宫颈鳞状细胞癌组织核糖体结合蛋白1、E2F转录因子1的表达及其临床意义

史璟，武燕*，孟红艳，常江

在全球范围内，宫颈癌在女性常见恶性肿瘤中患病率居于第二位，仅次于乳腺癌，世卫组织2012年调查显示全球每年宫颈癌新发人数超过50万，而我国每年新发病例占全球的28%[1]。宫颈肿瘤侵袭性较强，即便行手术治疗，术后也易复发、转移，中晚期预后欠佳[2]。宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)是宫颈癌的主要组织学类型，其发生与内质网应激有关，当机体出现病毒侵袭、炎症等情况时，细胞内质网处于失衡状态，可引起不同程度内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)反应，从而介导肿瘤细胞凋亡、自噬过程[3]。近年来，研究发现核糖体结合蛋白1(reticulum ribosome-binding protein 1，RRBP1)作为粗面内质网蛋白，与内质网应激有关，敲除其表达能诱发ERS，下调细胞活力，减轻致瘤性[4]。E2F转录因子1(E2F transcription factor 1，E2F-1)是转录因子家族的重要成员，对细胞周期有调控作用，能调节细胞增殖与凋亡，它对肿瘤细胞能产生多方面的影响，既能转录抑制，也可转录激活[5]。有学者研究发现miR-136可通过NF-κB信号通路靶向调控E2F-1表达，抑制宫颈癌细胞增殖[6]。目前，临床尚未明确RRBP1、E2F-1与CSCC的关系，关于CSCC的进展机制也有待进一步探讨。基于上述背景，本次选取83例CSCC患者进行研究，分析RRBP1、E2F-1在CSCC组织中的表达情况及临床价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取山西省肿瘤医院2017年7月至2018年1月收治的CSCC患者83例作为CSCC组，另选取同期于我院行宫颈活检的慢性宫颈炎患者80例作为对照组。纳入标准：① CSCC组：诊断标准参考《临床疾病诊断与疗效判断标准》[7]，经病理诊断证实为CSCC，年龄>18岁；入院前未接受过放疗、化疗；认知功能、沟通能力正常；对研究内容知情同意者。② 对照组：诊断标准参考《妇产科学》(第8版)[8]，有可疑宫颈病变且经宫颈活检证实为慢性宫颈炎，年龄>18岁；认知功能、沟通能力正常；对研究内容知情同意者。排除标准：患有其他原发性肿瘤；患其他危及生命的疾病，如严重的心脑血管疾病、肝病、肾病等。研究方案获我院伦理委员会批准。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 主要试剂为RRBP1抗体免疫组化试剂盒(上海彩佑实业有限公司，货号：CY-6574R)、E2F-1抗体免疫组化试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司，货号：s-11278R)、DAB显色剂(上海烜雅生物科技有限公司，货号：XY-MY-0075)。主要仪器为医用石蜡切片机(新乡市维克科教仪器有限公司，型号：VCM-1900B)、显微镜[奥林巴斯(北京)销售服务有限公司，型号：CX43]、恒温水浴箱(上海辅泽商贸有限公司，型号：HS-5001)。

1.2.2 检测方法 分别收集CSCC组手术切除的癌组织以及对照组的活检组织，利用免疫组化法检测组织中RRBP1、E2F-1的表达情况，具体如下：① 蜡块制备：获得组织块后，经PBS液进行冲洗，利用10%中性甲醛液将组织块浸泡4～8 h；将固定液倒掉，用蒸馏水、50%酒精分别清洗3次、2次，采用70%、80%、95%酒精以及无水酒精I、II逐级脱水；置于1∶1二甲苯石蜡混合液内45 min，利用二甲苯I、II各浸泡30 min；浸入石蜡，在58℃下行1∶1二甲苯石蜡处理，时间为45 min，石蜡I、II、III共反应2.5 h，进行组织包埋；采用切片机行石蜡切片，厚度为4 μm；取石蜡块置于50℃温水中浸泡，经载玻片捞片，将组织带黏于载玻片。② 免疫组化染色：在脱蜡之前，将组织芯片放置在室温下1 h，或经恒温箱(60℃)烘烤20 min，经二甲苯I、II浸泡，时间共25 min；置于无水酒精I、II内各2 min，然后置于95%、80%、70%酒精内各2 min；经PBS液清洗3次，5 min/次；加入3% H2O2去离子水反应10 min，将内源性过氧化物酶活性灭活；PBS液清洗方式同上；加入枸橼酸盐缓冲液(0.01 M)，煮沸，自然冷却，时间为20 min，PBS液清洗方式同上；滴加山羊血清封闭液，在室温下反应20 min，将多余液体甩去；加入50 μL一抗，在37℃下反应1 h，或者在4℃下过夜；PBS液清洗方式同上；取40～50 μL二抗加入，在37℃下反应1 h；PBS液清洗方式同上；滴加链霉亲和素-过氧化物酶，在室温下反应30～60 min；PBS液清洗方式同上；行DAB显色，时间5～10 min，利用显微镜观察着色情况；经苏木精复染2 min，利用自来水进行3次清洗，1 min/次；经盐酸酒精分化，时间为1 min，经自来水冲洗15 min，返蓝；脱水、透明以及封片，镜检。

表1 两组一般资料比较例(%)]

1.3 免疫组化结果判定

判定标准[9]：经高倍镜(×400)观察阳性细胞表达情况，根据阳性细胞数、阳性细胞染色程度进行评分，若出现棕黄、棕褐色则为阳性，阳性细胞主要在细胞核、细胞浆内。① 染色程度评分：无色、淡黄、棕黄、棕褐色分别计0分、1分、2分、3分。② 阳性细胞数占比评分：阳性细胞≤10%、11%～50%、51%～75%、>75%分别计1分、2分、3分、4分。二者乘积即为评分结果，0～3分为阴性，4～5分为弱阳性，6～7分为中度阳性，≥8分为强阳性，其中弱阳性、中度阳性、强阳性均记为阳性。

1.4 随访

术后通过门诊复查或电话及微信联络等方式对患者进行为期3年的随访，随访截止日期为2021年1月31日，记录患者的生存情况。

1.5 统计学方法

经SPSS 20.0软件行数据分析。计数资料用例(%)表示，行χ2检验。等级资料用例(%)表示，行秩和检验。应用Kaplan-Meier曲线及Log-rank检验分析不同RRBP1、E2F-1表达CSCC患者术后3年的生存情况。经多因素Cox回归分析CSCC患者预后的影响因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者病变组织中RRBP1、E2F-1表达情况比较

CSCC组患者RRBP1、E2F-1阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 两组患者病变组织中RRBP1、E2F-1表达情况比较[例(%)]

2.2 CSCC患者RRBP1表达与临床病理特征的关系

根据RRBP1表达情况将患者分成RRBP1阳性组与阴性组。不同FIGO分期、分化程度、淋巴结转移、肿瘤大小、脉管浸润、人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染情况的CSCC患者癌组织中RRBP1表达情况对比差异有统计学意义(P<0.05)；不同年龄的CSCC患者癌组织中RRBP1表达情况对比差异无统计学意义(P>0.05)，详见下页表3。

表3 CSCC患者RRBP1表达与临床病理特征的关系[例(%)]

2.3 CSCC患者E2F-1表达与临床病理特征的关系

根据E2F-1表达情况将患者分成E2F-1阳性组与阴性组。不同FIGO分期、分化程度、淋巴结转移、肿瘤大小、脉管浸润、HPV感染情况的CSCC患者癌组织中E2F-1表达情况对比差异有统计学意义(P<0.05)；不同年龄的CSCC患者癌组织中E2F-1表达情况对比差异无统计学意义(P>0.05)，详见下页表4。

表4 CSCC患者E2F-1表达与临床病理特征的关系[例(%)]

2.4 CSCC患者RRBP1、E2F-1表达情况与无瘤生存率、总生存率的关系

随访3年，无失访患者。RRBP1阳性组与RRBP1阴性组术后3年的无瘤生存率和总生存率比较，差异有统计学意义(P<0.05);E2F-1阳性组与E2F-1阴性组术后3年的无瘤生存率和总生存率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见下页表5，K-M生存曲线见110页图1。

表5 CSCC患者RRBP1、E2F-1表达与无瘤生存率、总生存率的关系

图1 不同RRBP1、E2F-1表达患者的无瘤生存和总生存曲线

2.5 CSCC患者预后影响因素的多因素Cox回归分析

利用多因素Cox回归分析模型对相关变量行量化赋值，以CSCC患者预后为因变量Y(生存=0，死亡=1)，结果提示FIGO分期、分化程度、淋巴结转移、脉管浸润、HPV感染以及RRBP1、E2F-1表达是CSCC患者预后的影响因素(P<0.05)，详见110页表6。

表6 CSCC患者预后影响因素的多因素Cox回归分析

3 讨论

宫颈癌是一种常见的妇科肿瘤，病理分型以CSCC居多，目前，临床针对CSCC已有多种治疗方法，如手术切除、放疗、化疗等[10]。癌症的发生可能与癌基因激活、抑癌基因活性丧失以及生长因子、细胞周期、细胞凋亡等多种因素存在关联，是以上因素相互作用、影响的结果。临床需尽早明确CSCC癌细胞调节、生长机制，这对肿瘤诊疗与预后判断有重要意义。彭彦才等[11]研究显示，RRBP1在食管癌中呈过表达，对预后有较大影响。国外研究提示RRBP1参与了口腔鳞状细胞癌进展，且会影响化疗耐药性，从而影响患者的化疗效果[12]。这表明RRBP1可能与肿瘤进展有关，但现阶段临床尚不明确RRBP1是否参与了CSCC进展，有待进一步论证。另有研究指出E2F-1也与肿瘤疾病相关，但其具备抑癌、促癌双重作用，在不同的肿瘤类型中可呈不同表达状态[13]。国外研究发现E2F-1与乳腺癌关系密切，通过对E2F-1表达进行抑制，能提升拉帕替尼和细胞毒药物在乳腺癌中的抗肿瘤效果[14]。目前，临床关于E2F-1与CSCC之间的关系尚未明确，仍需对此深入探讨。

本次研究结果提示，CSCC组的RRBP1、E2F-1阳性表达率较对照组高，提示二者可能与CSCC发生存在关联。RRBP1由1 410个氨基酸组成，在肿瘤细胞株中呈高表达，其在癌症中的作用机制比较复杂，可能与ERS作用有关[15]。癌症的发生通常伴有微环境异常表现，如慢性炎症、组织异常增生等，可导致内质网蛋白折叠机制被破坏，使错误折叠或者完全未折叠蛋白质聚集于内质网，细胞内环境处于紊乱状态并诱发ERS，而RRBP1可通过作用于ERS导致肿瘤细胞凋亡减少，促进癌症进展[16]。E2F-1在癌症组织中的表达存在特异性，研究表明其在胶质瘤、肝癌中呈高表达，但在前列腺癌中可见低表达，提示E2F-1在不同癌症中的作用机制可能存在差异[17-19]。本研究显示，E2F-1在CSCC中主要发挥促癌基因作用。这一作用机制可能在于E2F-1能与宫颈上皮细胞瘤蛋白结合，参与细胞凋亡过程，而E2F-1突变则可导致其与宫颈上皮细胞瘤蛋白结合失败，二者无法相互作用，导致E2F-1对细胞凋亡的调控作用削弱[20]。

CSCC患者RRBP1、E2F-1表达情况与临床病理特征存在关联，本次研究结果提示，二者阳性表达与FIGO分期、淋巴结转移、脉管浸润有关。董孟权等[21]发现甲状腺癌患者癌组织中RRBP1阳性表达率高于癌旁组织，且其表达与淋巴结转移、临床分期有关。这进一步提示RRBP1参与了癌症病理进展，临床需引起重视。Iglesias P等[22]研究提示E2F-1能对细胞周期进行调节，且在E2F-1表达过度活跃的情况下，容易造成肿瘤发生。这提示E2F-1与恶性肿瘤密切相关，参与了肿瘤疾病发生与进展过程。CSCC的主要转移途径为淋巴结转移，RRBP1、E2F-1可能通过某种机制，影响细胞内质网的微环境介导肿瘤进展，使癌细胞到达病灶周围淋巴管，并形成瘤栓，一旦癌细胞进入淋巴液，则会随其流动进入淋巴结，引起脉管浸润，增加淋巴结转移风险，临床可见FIGO分期增高。本研究提示RRBP1、E2F-1表达还与分化程度、肿瘤大小、HPV感染有关。分化程度越低的患者恶性程度更高，通常临床分期也高，肿瘤转移风险大。而肿瘤越大的患者能造成周围组织压迫，可能加重恶变程度。HPV感染与宫颈癌存在密切关联，持续的高危型HPV感染可引起宫颈癌前病变，诱发宫颈癌。上述恶性转化过程可能进一步加剧RRBP1、E2F-1的阳性表达，促进病情进展。本次研究结果显示RRBP1、E2F-1阳性患者的总生存率均较低，且二者是CSCC患者预后的影响因素。通过上述分析发现，RRBP1、E2F-1阳性在高FIGO分期、淋巴结转移、脉管浸润的患者中较常见，这类患者肿瘤恶变程度高，侵袭性强，病情往往更严重，死亡风险更高。此外，FIGO分期、分化程度、淋巴结转移、脉管浸润、HPV感染也与患者预后有关，这些均为常见因素，临床也需引起重视。Zhu J等[23]发现宫颈癌组织中RRBP1呈过表达，它可能是CSCC的新生诊断标志物。Yang C等[24]研究提示E2F1在宫颈癌中呈过表达，且与淋巴管侵袭、宫颈间质深部侵袭有关，对患者的总生存期、无病生存期影响较大。这均为本研究结论提供了支持，且本研究进一步揭示了二者与CSCC患者临床病理特征的关系，证实其表达与FIGO分期、分化程度、淋巴结转移、肿瘤大小、脉管浸润均有关，且二者均对无瘤生存率、总生存率有评估价值，临床有望通过分析RRBP1、E2F-1表达情况，辅助CSCC患者的预后预测。

综上所述，CSCC患者RRBP1、E2F-1表达以阳性为主，二者表达情况与患者预后密切相关。本研究局限性为选取样本量少，随访时间较短，未来还需扩大样本量，延长随访时间更深入分析二者作用机制。