HLA-DR联合AMH评估年轻不孕妇女卵巢功能的临床价值

李红宁，王美美，赵旭，刘亚静，马春明，崔淑英，王哲

不孕症是指育龄夫妇有正常性生活且同居1年以上，在没有避孕的情况下未能怀孕的疾病。近年来受全球气候环境和工业化发展等影响，不孕症在育龄期女性中的发病率也随之增加，且有低龄化趋势[1]。据调查资料显示，不孕症在我国的发病率约为10%，目前仍处于上升趋势[2-3]。卵巢储备功能是指女性的卵巢皮质区存在卵泡生长发育和受精的能力，可反映女性的生殖能力。育龄妇女的不孕与卵巢储备功能下降有关，既往研究发现，年龄、促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、雌二醇(estradiol，E2)、促黄体生成激素(luteinizing hormone，LH)、窦卵泡数(antral follicle count，AFC)等指标均可反映女性的卵巢储备功能，但敏感性不高，且随着女性月经周期而变化，对于女性卵巢功能的诊断并不理想[4-6]。研究发现人白细胞DR抗原(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)在卵巢组织细胞中异常表达，是判断女性不孕的有效指标之一[7]；抗缪勒管激素(anti-mullerian hormone，AMH)因其检测方便、预测时间早也成为诊断女性卵巢功能的重要指标[8]。本研究旨在通过应用HLA-DR和AMH联合诊断，探究其在预测和评估年轻不孕妇女卵巢功能的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年9月至2020年8月在保定市第一中医院就诊的年轻不孕女性患者110例作为研究对象，纳入标准为：① 月经周期规律，性激素水平正常；② 既往无子宫、卵巢等妇科手术史；③ 最近3个月内未服用过避孕药和性激素等药物；④ 患者及家属对本研究方案均知情同意；⑤ 年龄20～35岁，且不孕时间超过1年。排除标准：① 合并心脑血管疾病、免疫性疾病或因化疗、手术导致的卵巢衰竭等；② 有卵巢早衰或多囊卵巢等疾病；③ 合并有心、肝、肾等严重疾病；④ 患者为原发性不孕或因子宫器质性因素、输卵管因素等导致的不孕。参考人民卫生出版社《妇产科学》第八版中卵巢储备功能低下的诊断标准：基础FSH水平>10 U/L；基础卵泡刺激素/黄体生成素>3；早卵泡期FSH正常，而基础E2值>60～80 pg/mL。将所有研究对象分为卵巢储备功能低下组(观察组)48例和卵巢储备功能正常组(对照组)62例。本研究通过医院伦理委员会审查同意，所有入选研究对象均知情并签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 内分泌激素检测 所有患者在入院时填写姓名、编号、年龄等一般资料，月经周期第3天空腹抽取肘静脉血5 mL，用低速离心机(中科中佳，KDC-1044)4 000 r/min离心15 min，取上清液，采用全自动免疫分析仪(贝克曼库尔特UniCel Dxl 800)检测血清中FSH、LH、E2和AMH水平。所有操作步骤严格按照说明书操作规程进行。

1.2.2 HLA-DR水平检测 所有研究对象月经周期第3天空腹抽取肘静脉血5 mL，用肝素钠抗凝，离心分离出淋巴细胞，制成淋巴细胞悬液用于细胞浓度的测定。采用免疫双荧光染色方法，通过BD流式细胞仪(Accuri C6，美国)测定外周血中T淋巴细胞(CD3+)中HLA-DR的表达。使用CellQuest软件计算目标细胞占总细胞数量的百分比。

1.2.3 免疫细胞水平测定 抽取所有研究对象静脉血5 mL，4 000 r/min的速度分离5 min后取上清细胞，通过流式细胞仪检测CD3+、CD4+和CD8+中的T细胞亚群占总细胞的比例，并计算CD4+/CD8+的比值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组年龄、体质量指数、初潮年龄、孕次等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见下页表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组激素水平比较

观察组FSH、LH水平明显高于对照组，E2、AMH水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见下页表2。

表2 两组激素水平比较

2.3 两组免疫细胞和HLA-DR水平比较

观察组外周血中CD3+和CD8+细胞、HLA-DR的表达水平明显高于对照组，CD4+和CD4+/CD8+水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 两组免疫细胞和HLA-DR水平比较

2.4 AMH与HLA-DR联合诊断效能分析

以AMH与HLA-DR的水平为自变量，进行Logistic 回归分析并建立ROC曲线，评估AMH与HLA-DR的诊断价值。结果显示，联合诊断不孕女性卵巢功能低下的灵敏度最高(89.58%)，明显高于AMH和HLA-DR单独检测(75.00%和70.83%)，差异有统计学意义(P<0.05)。联合诊断在灵敏度较高的同时，还有着良好的准确度(78.18%)和约登指数(0.589)。详见表4。AMH与HLA-DR单独诊断以及联合检诊断女性卵巢功能的ROC曲线，见图1。

表4 AMH与HLA-DR联合诊断效能分析[% (例)]

图1 ROC曲线分析

3 讨论

据相关资料显示，全球不孕症人数约为6 000～8 000万，而我国不孕症的发病率高达10%左右。不孕症的病因复杂，只有明确不孕患者的具体病因，才能提供更为有效的解决办法。环境污染、推迟生育年龄、生殖系统疾病、心理压力大等因素都可能导致不孕发病率增加，目前我国不孕症发病率仍呈持续上升的趋势，严重影响夫妻间的关系和家庭生活的稳定，也成为年轻育龄夫妇首要解决的问题[9-11]。卵巢储备功能是指卵泡在卵巢皮质区生长、发育并形成可受精的卵母细胞的能力，是由卵巢内卵泡的质量和数量决定的，可反映女性的生育能力，临床上评估卵巢功能的指标只能在女性卵巢储备功能下降而出现临床表现时才能检测出，以致错过女性治疗不孕的最佳时期[12-14]。由于女性的生殖细胞不能再生，若卵巢储备出现耗竭将不可逆转，因此对于不孕女性，尤其是未生育的年轻女性，准确评估卵巢功能显得尤为重要。目前对于卵巢储备功能的评估，有年龄、激素水平、AFC等指标，但这些指标对评价卵巢功能也有一定的局限性，如单独采用年龄估测年轻妇女的生殖潜力时，准确性较差；对于激素水平检测要在女性月经周期的第2～4天进行，且需要排除卵巢囊肿的影响；超声测量AFC也受到特定时间、盆腔显影及受试者情况等影响，诊断效果欠佳。有文献推荐AMH和HLA-DR可作为检测女性卵巢储备功能的指标，可更早期反映女性卵巢的储备功能，了解不孕妇女的生殖潜能，对于提高女性不孕的诊断准确率，减少漏诊率极为重要[6，15]。

研究发现，FSH、LH和E2也能间接反映卵巢的储备功能，当卵巢储备功能降低时，基础FSH、LH水平上升，E2水平下降[16]，本研究结果显示，观察组的FSH、LH水平高于对照组，E2水平低于对照组，提示激素水平的变化参与女性的不孕进程。然而基础激素水平会受到多种因素的影响，预测价值较低。AMH是由窦前卵泡、小窦卵泡颗粒细胞分泌的一种糖蛋白，是检测卵巢功能较为新型的指标之一[6]。临床研究发现，AMH的表达水平会随着女性年龄增长而升高，在女性青春期时浓度可达到高峰，此后一直保持较高的水平状态，且不受女性月经周期影响，AMH的浓度越高表明卵巢内卵子数量越多，女性的生育能力越强。然而随着女性年龄增长及其他因素，颗粒细胞的功能将发生减退，AMH的表达水平开始出现下降趋势，直到女性出现绝经后将无法被检测出[17]。因此，AMH可用于评估女性的卵巢储备功能，与年龄、FSH、卵泡数量等因素也有一定的联系，具有较好的特异性和敏感性。但随着近年来研究发现，AMH也受到如吸烟、肿瘤、口服避孕药等多种因素的干扰，存在一定的波动性，影响诊断效能。

目前发现部分女性不孕症与患者自身免疫异常有关，卵泡颗粒细胞的凋亡是其发病的主要原因[18]。在不孕女性患者卵泡细胞膜上存在浆细胞和淋巴细胞浸润，并伴有淋巴细胞群的变化：CD3+、CD8+细胞水平升高，CD4+和CD4+/CD8+水平下降。随着患者卵泡逐渐增大、成熟，卵泡颗粒细胞受到主要组织相容性抗原-Ⅱ(major histocompatibility complex，MHC-Ⅱ)的不断浸润和破坏，颗粒细胞逐渐减少。伴随着CD8+等淋巴细胞的分化诱发机体免疫反应，使卵泡颗粒细胞凋亡，导致卵巢储备能力下降[18]。HLA-DR是MHC-Ⅱ类分子的产物，主要表达在单核细胞、B淋巴细胞等，可呈递抗原肽，在启动机体免疫应答过程中发挥关键作用[19]，因此患者外周血中T细胞亚群各水平的变化可反映患者体内存在T淋巴细胞介导的免疫应答。相关研究证实，免疫相关细胞的表达水平可通过参与免疫反应影响HLA-DR的水平变化[20]。本研究结果显示，观察组外周血中CD4+和CD4+/CD8+水平明显低于对照组，说明不孕症患者体内发生T细胞诱导的免疫应答。研究证实在卵巢功能不全患者卵巢组织中的HLA-DR表达明显增高，而在正常卵巢组织中呈阴性表达[21]。本研究结果发现，观察组患者与对照组在HLA-DR水平上有较大差异，这提示血清HLA-DR可参与女性不孕的致病过程，激活人体中辅助T淋巴细胞识别自身抗原，诱发自身免疫反应。然而某些患者血清中针对HLA-DR抗原的污染物结合，可导致假阳性，极易增加女性不孕患者的漏诊率和误诊率[22]。

既往研究证实，采用多项血清标记物联合检测有利于提高疾病诊断效能，故本文探讨采用AMH与HLA-DR联合检测对女性卵巢能力的诊断效能。研究结果显示，经AMH与HLA-DR联合诊断条件下评估卵巢储备功能的灵敏度最高(89.58%)，明显高于AMH和HLA-DR单独检测(75.00%和70.83%)，差异具有统计学意义。联合诊断在特异度较高的同时，还有着良好的约登指数(0.589)，且准确度(78.18%)最高；联合检测ROC曲线下面积为0.839，显著高于AMH与HLA-DR单独检测及系列联合检测(0.767、0.720)，推测将AMH与HLA-DR联用对女性卵巢功能进行更全面评估，更有利于提高诊断效能，可以更准确地指导年轻女性不孕患者的最佳治疗时间。但本研究也存在一些局限性，例如对不孕患者其他病理性原因的相关因素未纳入分析；本研究的病例数较少，依靠简单的分组数据不能完全可靠，可能导致结果发生一定的偏差。因此，还需要对年轻不孕女性患者进行样本数量的扩大，并考察其他相关影响因素，对患者发生不孕的原因作进一步研究。

综上所述，HLA-DR及AMH联合可提高对年轻不孕女性卵巢功能的评估诊断效能，对制定个体化方案具有重要的参考价值。