外泌体源miRNA在子宫内膜癌中的研究进展

陈洁，洪于贺，尹乐乐，沈媛*

子宫内膜癌(endometrial carcinoma，EC)在女性最常见的恶性肿瘤中排名第六，占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%，其在世界范围内的发病率及死亡率均有上升趋势，据统计数据预计我国的EC发病率逐年增长3.7%[1]。EC的临床表现多见阴道不规则流血、阴道排液等，晚期可出现恶病质表现。虽然临床上可以通过阴道流血或排液增多等症状来初步判断EC，但明确诊断需要进一步完善检查，因部分患者对诊刮、宫腔镜等检查存在恐惧心理而推迟检查，延误最佳诊治时机，确诊时可能已经处于疾病晚期，从而增加了EC的病死率。经诊刮明确子宫内膜是否存在病变时，因病灶大小不明确、取材医师无法准确掌握病灶分布位点，可能遗漏局限小病灶，从而增加EC漏诊率，有文献报道分段诊刮对宫颈受累诊断的漏诊率高达17.65%[2]。此外，许多发病年龄介于30～50岁的子宫内膜不典型增生患者因有生育需求而选择孕激素治疗，可能因此漏诊早期EC，错过治疗时机。当前治疗EC仍以手术为主，根据高危因素选择是否联合放化疗。晚期EC因扩散转移、分化差，预后也差。尽管辅助治疗使得患者的预后有所改善，但总体上5年生存率无明显提高。因此，寻找有效的早期诊断标志物和精准的治疗靶点极其重要。

外泌体(exosome)是细胞在受到环境刺激或活化时分泌释放的一种脂质双分子层囊泡，直径约30～100 nm，可将所携带的生物活性物质，例如脂质、蛋白质、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)等等，转移到细胞外，从而在运输物质、传递信息、监督免疫、介导血管形成及肿瘤的发生发展等诸多生理病理过程中扮演重要角色，是一种新的细胞间交互方式[3]。miRNA属于非编码RNA，长度约19～25个核苷酸，参与调控基因表达的转录后部分[4]。外泌体源miRNA(exosomal-microRNA，exo-miRNA)是一类可调控靶基因的非编码蛋白质单链RNA分子[5]，可发挥类似RNA干扰作用，通过与靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3’非翻译区互补配对形成特殊的双螺旋结构后再解旋形成两条单链RNA，其中一条单链RNA与RNA诱导的沉默复合体结合，形成miRNA蛋白复合体，从而降解靶mRNA或抑制其翻译，在转录水平调控靶基因的蛋白表达。目前有研究表明exo-miRNA与EC的发生有关联，可能在该疾病进展中有重大影响。现对exo-miRNA在EC中的研究进展作一综述，以期为EC的早期诊治提供新思路。

1 外泌体

外泌体是细胞主动分泌产生的囊性小泡，通过细胞内吞途径，将胞质中的脂质、蛋白质、ctDNA及miRNA等聚集在囊泡内，再经过囊泡与质膜的融合，最终裂解释放，将其携带的生物活性物质排出细胞外[6]，以自分泌、旁分泌、体内循环等方式到达相邻或远端的靶细胞，通过细胞膜间的直接接触或者具有抗原活性的表面质膜上的特异性受体传递信息[5]，从而起到相应的细胞间交互作用。这种自发性分泌外泌体的生理现象存在于神经细胞、肿瘤细胞、心肌细胞等多种细胞中，因为外泌体存在于胸水、腹水、尿液等各种体液或组织细胞中[7]，故临床上应用液体活检在早期诊断肿瘤、评估疾病进展及预后等方面具有重要价值。

此外，外泌体作为机体自身的分泌物，具有质膜稳定、分布广泛、便于获取等药物载体的基本特征，具备毒性低、免疫原性低、渗透性良好、可定向运送药物等优点[8]，故其可作为药物载体的选择之一，主要以直接转染法、间接转染法、穿孔[9]等3种方式运载药物。关于外泌体如何调控基因表达及如何应用于肿瘤的早期诊治等已成为当前的研究热点。

2 外泌体源miRNA对肿瘤细胞的调控

肿瘤的发生源于细胞癌变，发展则是癌细胞恶性增殖、侵袭转移的过程。快速增殖的癌细胞聚集后为实质肿瘤的形成提供有利的生长微环境，而exo-miRNA在其中起调节转化的作用，通过转化相关细胞的作用促进肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)形成，不仅能加速正常细胞的癌变增殖，还能改变邻近及远处非肿瘤细胞的生物学特性以利于肿瘤细胞转移。当前已证实exo-miRNA是肿瘤细胞用于实现自身功能机制的重要衍生物，可调控受体细胞的信号通路及蛋白质表达，因而其对肿瘤细胞的调控机制引起了学者的注意。

有研究表明外泌体及其携带的miRNA可释放于TME被各种邻近细胞吸收，进而调控肿瘤进展[10]。exo-miRNA对肿瘤的增殖及侵袭的影响主要通过调控血管生成、上皮-间质转化及免疫调节等来影响。Webber JP等[11]发现外泌体主要通过诱导间质干细胞分化为成纤维细胞，促进肿瘤血管形成，从而增强肿瘤的侵袭力。Zhang ZC等[12]发现肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs)介导的肿瘤进展与exo-miRNA相关。Zhou Y等[13]研究结果显示，肝癌细胞来源的外泌体miR-21可直接靶向磷酸酶基因PTEN，激活肝星状细胞中的PDK1/AKT信号通路，将肝星状细胞转化为CAFs，通过血管生成影响炎症微环境、促进肿瘤侵袭。在TME中，多种细胞来源的exo-miRNA被递送至内皮细胞，通过调控其下游靶基因的表达，刺激诱导肿瘤血管生成，从而驱动肿瘤细胞的侵袭转移。Sun X等[14]研究表明，胶质瘤干细胞来源的外泌体miR-21通过刺激miR-21/血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)/VEGF受体2这一信号通路来促进内皮细胞的血管生成能力。Bao L等[15]研究显示鼻咽癌细胞分泌的外泌体miR-23a可直接靶向睾丸特异性抗原(TSGA10)，抑制靶基因表达，加速肿瘤内皮细胞的血管生成。

外泌体在免疫细胞与肿瘤细胞间的通讯中起双重调节肿瘤免疫的介质作用，其将原始细胞内的miRNA传递到靶器官、靶细胞中，通过调控肿瘤及其微环境中基质细胞的生物信息网络来影响肿瘤细胞的发展方向。不同肿瘤细胞来源的exo-miRNA的结构与功能也不同，因其与肿瘤的形态、分级分期、迁移侵袭及化疗耐药等密切相关，可作为提示肿瘤进展及治疗效果的标志物[16]。肿瘤来源的外泌体涉及肿瘤的免疫逃逸过程，主要通过影响免疫抑制细胞的激活与分化，调节抗原呈递，从而抑制免疫细胞的活性并诱导相关效应细胞凋亡。Ye SB等[17]研究显示，鼻咽癌来源的血清外泌体可将miR-24-3p转运至T细胞，靶向抑制成纤维细胞生长因子11介导的T细胞抑制，从而促进肿瘤增殖、分化，发生免疫逃逸。此外，肿瘤细胞在快速生长过程中导致组织内部缺氧，促进缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor，HIF-1α)表达上调，进而刺激肿瘤细胞分泌具有增强血管生成和转移潜能的外泌体，促进肿瘤的侵袭转移。Chen X等[18]发现miR-125b-5p、miR-21-3p与miR-181d-5p这3种exo-miRNA在上皮性卵巢癌中因HIF-1α作用导致高表达，进而调节细胞因子信号抑制蛋白4(suppressor of cytokine signaling 4，SOCS4)/SOCS5/信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信号通路，促进巨噬细胞M2型极化，从而促进肿瘤增殖、迁移。

3 外泌体源miRNA在子宫内膜癌中的作用

3.1 外泌体源miRNA对子宫内膜癌的调控

不同来源的exo-miRNA具有不同作用，同种exo-miRNA在不同的TME中作用也不同。exo-miRNA可起促癌基因的作用，也可扮演抑癌基因的角色，这可能与TME的组成成分有关，尤其是CAFs[12]。Maida Y等[19]研究发现Ishikawa细胞来源的外泌体携带的功能性miRNA会被邻近的子宫内膜成纤维细胞内吞，从而改变原子宫内膜成纤维细胞的miRNA表达谱。该研究结果提示EC细胞来源的外泌体和子宫内膜成纤维细胞之间存在相互作用，exo-miRNA可作为肿瘤细胞调节TME的通讯介质。Liu XJ等[20]研究表明exo-miRNA可以调控子宫内膜细胞的黏附、侵袭及血管生成能力，并能调控子宫内膜细胞的增殖与凋亡。Yan GJ等[21]研究首次发现miR-302簇可直接靶向Cyclin D1，间接调控细胞周期蛋白依赖性激酶1基因表达，从而抑制子宫内膜细胞株Ishikawa和HEC-1B的增殖和迁移，并将细胞周期阻滞在G2/M期，抑制癌细胞的增殖分化以及降低致瘤性。Li YB等[22]经过一系列检测发现miR-302b-3p/302c-3p/302d-3p在EC中表达下调并改变了EC细胞系Ishikawa和HEC-1A的上皮-间充质转化过程，该基因簇可促进Ishikawa和HEC-1A细胞凋亡的能力，显著抑制锌指转录因子ZEB1、B淋巴细胞瘤-2基因的表达，促进了凋亡前体蛋白Bax的表达，将细胞周期阻滞在G0/G1期，从而抑制了Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖和迁移。章燕等[23]利用miR-107抑制剂下调miR-107表达，发现雌激素受体α的蛋白表达增加，Ishikawa细胞的增殖迁移及侵袭能力下降，提示miR-107可能在EC的进展中发挥重要作用。

随着相关研究的不断深入，exo-miRNA对EC侵袭转移能力的影响机制会越来越清晰，这对于深化EC的临床治疗研究大有裨益。

3.2 外泌体源miRNA在子宫内膜癌诊治中的应用

3.2.1 外泌体源miRNA可考虑作为子宫内膜癌的生物标记物 随着越来越多与肿瘤相关的miRNA谱被发现，miRNA逐渐作为疾病诊断的生物标志物引起了学者关注。研究表明，外泌体在体液中具有良好的稳定性，其成分和功能与细胞来源有关，不同疾病会引起特定细胞释放的exo-miRNA出现特异性表达，且囊泡形式可减少遗传物质受RNA酶的作用，提示exo-miRNA可作为潜在的疾病诊断生物标志物，在疾病的早期诊断中具有重要价值。Srivastava A等[24]利用EC患者的尿液分析exo-miRNA表达谱，发现所研究的84个miRNA中有54个在qPCR中被扩增，其中hsa-miR-200c-3p富集程度最高，提示存在差异表达的exo-miRNA可考虑作为诊断EC的生物标志物。Tsukamoto O等[25]采用二代测序法鉴定组织及血浆中与EC相关的miRNA，在血浆中鉴定出4个与之相关的miRNAs(miR-135b和miR-205表达上调，miR-30a-3p和miR-21表达下调)，而子宫切除术后血浆中与之相关的miRNAs(miR-135b、miR-205和miR-30a-3p)的循环水平明显降低，经受试者工作特征曲线 (receiver operating characteristic curve，ROC曲线)分析显示，血浆miR-135b和miR-205水平的曲线下面积分别为0.9722(95%CI：0.913-1.0)和1.0(95%CI：1.0-1.0)，说明以血浆中miR-135b与miR-205作为诊断EC的生物标记物具有较高的准确性，对其早期诊断以及监测复发有较高价值。陈佳等[26]通过对比230例EC患者与250例健康女性的血清中lncRNA ROR及miR-29表达水平，采用ROC曲线分析两者对EC的诊断价值，发现EC患者的血清lncRNA ROR与miR-29水平显著高于健康女性，且二者表达水平在TNM Ⅰ～Ⅱ期患者中增高最为显著，说明联合血清lncRNA ROR与miR-29测定对于EC的早期诊断及发病风险预测具有较高价值。

无创液体活检技术是目前获取外泌体的主要方式，不仅可以反映原发性肿瘤与继发性肿瘤的分子特性，还能重复操作、实时活检，获取信息比组织活检更快捷、全面、客观。利用液体活检技术、宫腔灌洗液等寻找外泌体作为EC的标志物是诊断早期EC的发展方向。然而，由于目前缺少快速检测外泌体表征的技术方法，用传统方法获取外泌体的纯度和得率较低，难以实现高通量检测，这是要以外泌体作为疾病诊断的分子标记物亟待解决的问题[27]。

3.2.2 外泌体源miRNA应用于子宫内膜癌的治疗 目前EC的治疗方式仍以手术为主，化疗适用于晚期、复发或具备高危因素的术后患者。肿瘤药物治疗的主要问题在于肿瘤耐药，尤其是复发性肿瘤，因获得性耐药使得治疗效果不理想，有研究显示exo-miRNA在TME中的通讯作用可能是耐药性增强的原因之一。Kanlikilicer P等[28]通过共培养实验研究卵巢癌中外泌体miR-1246对巨噬细胞摄取的影响，发现miR-1246在卵巢癌外泌体中存在过表达，并通过调控窖蛋白-1/糖蛋白/M2型巨噬细胞轴增强肿瘤细胞对紫杉醇的耐药性，而紫杉醇联合miR-1246抑制剂时，肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性显著增加，说明肿瘤细胞产生的exo-miRNA可能通过调控肿瘤周围浸润的免疫细胞来促进肿瘤的发展，该研究也为提高肿瘤患者对化疗药物的敏感度提供了新思路。

靶向exo-miRNA治疗肿瘤也是一种新型有效的治疗方式。有研究表明一个miRNA可以同时靶向数百个mRNA，通过调节多个靶mRNA的转录后活性来影响细胞的生物学功能，提示靶向miRNA作为治疗手段具有可行性[29]。基于外泌体可运载与肿瘤侵袭转移、血管生成及耐药相关的蛋白质和核酸等物质这一特点，抑制携带“癌基因”的外泌体生成或者摄取，促进携带“抑癌基因”的外泌体的生成或摄取，也为未来外泌体应用于肿瘤治疗提供了新方向。已有相关研究表明miR-302簇可抑制EC细胞的增殖分化，显著影响肿瘤进展[21-22]，提示miR-302簇可作为肿瘤抑制因子用于EC的治疗，构建外泌体miR-302簇有望成为靶向治疗EC的选择之一。

此外，外泌体可作为药物载体参与肿瘤治疗。外泌体通常以3种途径参与疾病治疗，一是直接携带其来源母细胞中的物质进入对应的受体细胞，进而影响靶细胞功能;二是作为药物载体将靶向药物直接运输到靶器官或靶细胞，从而达到治疗目的;三是对外泌体进行一定程度的改造，增强其靶向性，延长其半衰期，从而持续有效地治疗特定疾病。前两种方法的缺点在于天然外泌体囊泡表面可能含有多种不同配体或受体分子，意味着其可能同时作用于多种受体细胞，靶向性不够精准，可控性较低；而对外泌体进行改造虽然增强了靶向精准性，但可能会丧失其作为内源性物质低免疫原性的先天优势，改造后的外泌体能否避免机体的免疫应答有待进一步研究。随着改造技术的发展，工程化外泌体取得了一定进展。Kemarker S等[30]研究表明，工程化的外泌体比原始外泌体的靶向治疗效果更强，还能最小化细胞毒性，抑制肿瘤生长效果显著。

总的来说，如何改进药物载体、利用exo-miRNA找准治疗EC的靶点，减少不良反应，提高治疗的有效性和特异性，是将exo-miRNA应用于EC治疗中亟待解决的问题。

4 结语

EC作为女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，对女性健康造成了严重威胁。随着人们对EC的分子机制研究不断深入，发现exo-miRNAs在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色，其在EC中的作用机制和诊断治疗方面也取得了一定程度的进展，为EC早期诊断及治疗提供了新的展望，将来有可能为成为监测疾病发生与预后的重要手段。