DNA甲基化与哺乳动物生殖的研究进展

刘晶莹，陈秀娟，戴柏，张雪妍

DNA甲基化是历史最为久远且研究最为深入的表观遗传修饰之一，与基因调控的关联紧密。可在DNA序列不进行变动的条件下改变遗传基因的表达，对染色体的表观遗传调控起关键作用。2014年，以汤富酬、乔杰为核心的专家组第一次对人类早期胚胎发育中的DNA甲基化展开探索，研究发现基因组整体的去甲基化在2-细胞阶段已经基本实现[1]，甲基化除了在转座子沉默(transposon silencing)、基因组印记、X染色体活性丧失中起作用，还参与早期胚胎发生、干细胞分化、神经元发育调控和癌细胞转移等多个细胞过程[2]。早期胚胎生长发育时期均会经历去甲基化和重新甲基化，而几乎全部哺乳动物发育阶段的甲基化过程都被去除，随后在子代重新构建。更深层次地探求在早期胚胎生长发育时期的作用机制和功能特性，对人类及其相关疾病的研究有重要价值。本文综述了近年来DNA甲基化修饰在哺乳动物生殖发育过程中的研究进展，以期为该领域的研究提供有价值的参考。

1 DNA甲基化和去甲基化

1.1 DNA甲基化

DNA甲基化指借助DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的引导，将一个甲基转移到胞嘧啶的5′C中，导致5′胞嘧啶转变为5′甲基胞嘧啶的过程。DNMTs活性的增加可以使DNA发生异常甲基化并引起染色体的不稳定。当前，我们在哺乳动物体内已发现的DNA甲基转移酶家族有6种，包括：DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b、DNMT3c以及DNMT3L。

人体内的DNMT1数量最多，在研究人类胚胎干细胞后我们发现敲除DNMT1后，多能性基因POU5F1、CD24等的表达下降且NODAL信号通路相关的基因NODAL、CER1、LEFTY1/2的表达被激活[3]。说明DNMT1参与胚胎干细胞分化。

DNMT2无法实现DNA甲基化的RNA转移酶，其能够导致天冬氨酸tRNA反转录环中的胞嘧啶38位甲基化，关键在于其影响天冬氨酸的tRNA甲基化，在生殖器官、肌肉组织和内脏器官的胚胎期中表现的水平较高[4]。去除了DNMT2的小鼠，仍然拥有正常的生殖功能，且甲基化形式和基因组无异常，然而却失去了RNA甲基化酶的活性[5]。

DNMT3家族(甲基转移酶3a、甲基转移酶3b、甲基转移酶3c和甲基转移酶3L)，主要起加快新的甲基化位点产生变化的作用，将该过程定义为从头甲基化[6]。在胚胎早期发育过程中，后代胚胎着床阶段的DNA甲基化模式主要依靠DNMT3a和DNMT3b来建立，之后的发育中靠DNMT1维持。即使DNMT3a和DNMT3b在作用上相近，但两者的表达形式区别很大。前者的表达范围更大，而后者唯有在睾丸、骨髓及甲状腺内拥有高的表达水平。如单一敲除DNMT3a或DNMT3b，两者造成胚胎的致死时间不同，暗示了他们在胚胎发育过程中发挥作用的主要时期有别。Yin LJ等[7]的实验结果显示，当胚胎中DNA的维持甲基化被限制，会降低胚胎着床率及升高胎儿死亡的概率。近几年的探索将DNMT3c归于从头甲基转移酶，能够防止雄性生殖细胞被转座子干扰，维持生殖功能。从DNMT3L角度来看，其既缺乏主要的DNMT序列，同时也没有获得DNMT酶活性，却能够担任从头甲基化中DNMT3a和DNMT3b的控制因子。在去除了DNMT3L的幸存小鼠中，雄性会失去生殖能力；在雌性后代中，敲除该基因的胚胎会由于神经管缺陷不能发育到足月[5]。DNA甲基化得以实现有赖于DNMTs的催化作用，保证了生殖及胚胎发育过程顺利发生。

1.2 DNA去甲基化

主动和被动去甲基化均属于DNA去甲基化过程，指的是胞嘧啶取代5-甲基胞嘧啶的反应。哺乳动物完成受精后，分别源于精卵的不同母源DNA没有在同一时刻完成甲基化，父源部分的去甲基化过程快速且覆盖广，称为主动去甲基化，而母源部分在胚胎的生长前期发生卵裂和DNA复制的途中逐渐完成去甲基化，该过程属于依赖型DNA复制，将其定义为被动去甲基化[5]。主动甲基化指的是借助相关酶的功效，去除甲基的过程。在哺乳动物配子发生和胚胎生长前期中，该反应始终遍布于基因组区域[8]。被动去甲基化基本处于S期，其主要功能在于确保DNA复制途中DNMT的活性丧失，避免新的DNA链发生甲基化[8]。主动甲基化的功能基本由TET(ten-eleven translocation)家族引导，该类蛋白的主要种类有TET1、2和3。该家族能够将5-甲基胞嘧啶氧化，获得5-甲酰基胞嘧啶(5 formylcytosine，5-fC)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyluracil，5-hmC)和5-羧甲基胞嘧啶(5 carboxylcytosine，5-caC)[9]。

TET1在胚胎生长中首先被激活，这对确保功能多样的干细胞干性至关重要，该蛋白在干细胞中的表达水平下降能使该细胞失去分化与多样性[10]。胚胎一旦缺乏TET1就无法获得正常的囊胚，呈现出异常形态。在四倍体互补实验过程中，缺少TET1的小鼠胚胎可发育至足月且能够生存并繁殖，但后代的幼儿体型偏小[5]。

TET2基本在全部组织中表达，尤其在造血细胞和干细胞中为高表达，影响造血干细胞的增殖与分化，如表达缺失将导致血液细胞分化受阻，使造血干细胞室进行性增大，最终引起体内骨髓增生，如脾脏肿胀、单核细胞恶性增殖以及髓外造血，均可导致恶性血液肿瘤的出现[11]。

TET3在胚胎发育早期向神经分化时期表达水平提高[12]，加快了神经元发育。另有研究表明TET3可介导配子基因组的甲基化调控，并在配子发育过程中持续表达[13]。凡去除TET1或3基因的小鼠胚胎发育10.5天后对比普通胚胎存在发育缓慢、细胞死亡等状况，无法完成持续生长[14]，表明两类蛋白在胚胎前期发育过程中都发挥至关重要的作用。

2 DNA甲基化与生殖

哺乳动物的胚胎发育时，胚胎早期发育阶段和配子体形成阶段分别发生两次整体范围的去甲基化和再甲基化。第一次的重编程始于原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)中全局甲基化的消除，并在生殖细胞发育的后期建立性别特异性甲基化模式。第二次发生在受精后，包括从配子中遗传的大多数甲基化标记的擦除和随后胚胎甲基化模式的建立[6]。PGCs可以得到雌雄两性的生殖细胞，在分化过程中即开始去甲基化，并在一段时间后进行重新甲基化，引发单亲系特定印记有关范围在内的特异性甲基化位点重新组合[15]。在小鼠的PGCs发育过程中，PGCs分化始于第6.5天，第13.5天甲基化的平均值位于峰谷，此时全基因组的DNA甲基化水平基本为5%[16]。雄性PGCs在13.5天后重构甲基化体系，雌性相比于雄性开始时间更晚。待完成再甲基化，雄性PGCs的甲基化程度相比雌性水平更高，最终得到精卵。

2.1 精子发生与DNA甲基化

精子的诞生过程属于细胞严密且复杂的分化，如成熟分裂、基因重组、精子顶体和鞭毛的出现、染色质的重塑和凝集等[17]。精子在完成受精前呈现高度DNA甲基化，然而之后精原核进行活跃、积极、迅速、且不依赖DNA复制去甲基化，使甲基化程度保持较低状态直至进入桑椹阶段[18]。所以，精子甲基化程度的异常变化或许是造成原因不明的早期流产或胚胎生长停滞的关键因素[19]。现有证据认为,印记基因中DNA甲基化的异常与男性的不育症关联紧密。H19基因的甲基化不正常能够干扰精子的产生，引起精子数量的下降。对比患有少精症的患者和健康男性精子DNA内该基因的甲基化程度后得知，在少精患者中,H19-DMR的CpG岛甲基化程度相对较低，而在健康精子的DNA当中，未观测到甲基化水平变化[20],所以该基因可能会成为评估人体精子健康的指标[21]。Xu J等[22]对FAM50B和GNAS两种印记基因的CpG岛的调查结果表明，患有少精子症患者的这两种印记基因甲基化程度相比于健康男性较低，提示GNAS和FAM50B基因的异常甲基化与精子活力低下相关。Poplinski A等[23]对无法生育患者和健康男性的精子中母源印记基因的甲基化开展调查，在精子健康率小于5%的患者中,母源印记基因MEST的甲基化水平的平均值为7%，对比对照组的3.5%以及健康形态大于5%的患者甲基化为6.3%，表现为显著的高度甲基化，这暗示母源印记基因的高度甲基化能够引起精子总量、形态的变化。Botezatu A等[24]调查得知母源印记基因甲基化水平较低可以导致精子活性降低,进而降低生殖能力。深入探讨研究男性不育的病因,可以很大程度上帮助筛查、诊断和治疗男性不育，有助于提高生育能力。

2.2 卵子发生及DNA甲基化

卵子产生过程可细化为：雌性生殖细胞增殖、分化以及成熟[25]。在卵细胞产生及胚胎附植前的进程中，DNA甲基化在严密控制与发育有关基因的激活或抑制，并在快速构建双亲印记上发挥着不可估量的作用。在卵细胞形成过程中，卵细胞特异的H3K4去甲基化酶KDM1B在建立一些印记基因的差异甲基化模式时是必不可少的[26]。GV期的卵母细胞甲基化随出生时长增加而增大，并于青春期到达MII卵母细胞中的峰值。甲基转移酶和MII期的卵母细胞染色质关系紧密，并在附植前的发育时期一直储存于细胞核内[27]。

2.3 早期胚胎中的DNA甲基化

通过研究早期的胚胎发育得知，人类早期胚胎中甲基化变化与小鼠及其他多种哺乳动物都十分类似。大致符合生殖细胞的高水平甲基化和胚胎的低水平甲基化，亲本的甲基化信息在受精卵中会经历大范围的消除和重构。当配子结合后，雄性原核细胞中的DNA甲基化会立即显著降低，而雌性胚胎中的8细胞期和雄性胚胎中的胚泡期的DNA甲基化会更高[28]。小鼠精子甲基化的均值约80%，卵子则为50%左右，受精结束的3.5天时的ICM时期甲基化水平最低，约为20%。胚胎从该时期生长至7.5天，在整体区域内进行甲基化重构，甲基化程度的均值高达73%[16]。在体外受精过程中，着床之前进行甲基化重构的时间段会因生物种类的差异而有所不同，小鼠胚胎的甲基化重构于囊胚阶段开始，猪的该过程在8-细胞期开展，羊在桑椹胚阶段的甲基化程度显著提高，而牛位于16-细胞期时甲基化程度逐步提高，人类体外受精胚胎中此过程一般从囊胚期进行。在胚胎发育早期，DNA甲基化整体的水平从1细胞至16细胞胚胎呈持续下降状态，而在胚泡阶段逐渐开始升高[29-30]。在受精卵中，亲本基因组在原核生物中被分隔在不同位置，母体基因组的全局性DNA甲基化程度相比父本更低。两者以各自方式完成全基因组DNA去甲基化。所以，胚胎在囊胚阶段到达甲基化程度的最低点[31]。

DNMTs家族及TET家族均在胚胎发育过程中起作用。其中DNMT3家族的功效更为显著，DNMT3a及DNMT3b在胚胎早期的作用是控制新生甲基化，前者属于母源存储并在两性配子中构建不同的甲基化体系[32]，后者伴随着合子基因组的激活(zygotic gene activation，ZGA)开始转录，且在囊胚阶段完成高度表达。去除DNMT3b的小鼠大约在9.5天死亡,而去除DNMT3a的小鼠会在出生后28天死亡。两者联合双敲除的表型后果相比单独去除更加严重，胚胎会在10.5天死亡。通过RNAi实验下调TET基因的表达发现[33]：单雌性激活2-细胞胚胎和受精2-细胞胚胎DNA 5-caC的产生都受TET蛋白控制,对于前者而言，TET1的效果更明显,而在体内受精胚胎中TET1和TET3的作用更强。表明该基因能够同时在1-细胞和2-细胞胚胎中引导5-caC产生。另外，RNAi研究结果还表明,TET基因表达下调对胚胎发育的囊胚率有直接作用,提示该蛋白在胚胎发育时期扮演着至关重要的角色。

3 展望

DNA甲基化在哺乳动物生殖发育阶段起到不可估量作用，探索生殖阶段发育的变化，表明胚胎生长前期DNA甲基化起到的修饰效果，为研究编程重构提供了无可替代的帮助。早期胚胎甲基化的探索也为深入进行哺乳动物DNA甲基化研究铺平了道路。但目前仍有许多机制尚不清楚，DNA甲基化与多能因子如何相互作用，如何调控分化的，在胚胎各时期有哪些基因位点发挥作用等问题仍待解决。全面了解表观遗传在体内的重编程将促进体外实验重编程的发展，也可能有助于开发新的治疗不孕症、印记疾病和其他发育障碍的策略。