龙须菜蛋白质的提取及其酶解产物的抗氧化特性
2022-06-01杨贤庆陈胜军吴燕燕李来好邓建朝
刘 晶,胡 晓,杨贤庆,*,陈胜军,吴燕燕,李来好,戚 勃,邓建朝
(1.上海海洋大学 食品学院,上海 201306; 2.中国水产科学研究院 南海水产研究所,国家水产品加工技术研发中心,农业农村部水产品加工重点实验室,广东 广州 510300)
龙须菜()属于红藻门、杉藻目、江蓠属植物。龙须菜是我国第三大经济藻类,分支多且生长快、生长周期长。由于其含胶量高,早期主要被用作提取琼脂的原料。近年来,研究者多对龙须菜源多糖进行研究,已证明具有抗病毒、抗肿瘤活性、免疫调节作用、抗衰老作用等在内的多种活性,但对龙须菜蛋白的研究较少。随着对龙须菜了解的深入,发现龙须菜不仅蛋白质含量高,而且必需氨基酸所占比例高(占总氨基酸含量的35.5%)、种类齐全,还含有具有生理活性的牛磺酸,是营养价值较高的蛋白质资源。此外,龙须菜藻胆蛋白还具有清除自由基、抗肿瘤及提高小鼠免疫能力的活性作用。
现代研究认为,人类摄入蛋白质后,消化道的酶将其分解为小肽或氨基酸,绝大多数以小肽的形式消化吸收,少数以游离氨基酸形式吸收。生物活性肽是一种介于2~20个氨基酸的序列,分子量通常小于6 ku。由于氨基酸组成的多样化,使其具有多种生物活性,包括抗氧化、抗冻、免疫调节、抗菌等功能。
蛋白质提取的方法常有渗透法、浸渍法、冻融法、均质法和溶剂萃取、超声破碎和纤维素酶法等。其中超声运用频率大于20 kHz的声波产生压缩和减压,对细胞产生破碎、侵蚀、声毛细血管效应、声穿孔、局部剪切应力和植物细胞壁基质的破坏性损伤。本实验将超声辅助碱提酸沉法运用在龙须菜蛋白质的制备上。超声波辅助法具有操作便利,提取时间短,溶剂消耗小,得率高等优势,作用于大型海藻细胞壁,可增加组织的多孔性和渗透性,提高蛋白溶出效果,并获得溶解性和乳化性较好的蛋白质。以液固比、碱浓度、超声时间和超声温度对蛋白质提取率的影响实施单因素实验。依据Box-Behnken中心组合设计原理设计响应面,根据实验结果得到回归模型以及各因素交互作用的响应面3D图和等高线图,确定出最优龙须菜粗蛋白质提取工艺方案。制备出龙须菜蛋白质,并测定其氨基酸组成。此外,分别使用5种酶(木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、植物蛋白复合酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶)对龙须菜蛋白质进行酶解,测定酶解产物的抗氧化活性和分子量分布。并利用红外光谱扫描比较龙须菜蛋白质及其酶解物的结构特性。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
龙须菜(),广东省汕头市南澳岛采收,于60 ℃烘箱中干燥至恒重,粉碎过80目筛,密封保存;BCA试剂盒,南京建成生物有限公司;木瓜蛋白酶,碱性蛋白酶,植物蛋白复合酶,胰蛋白酶,胃蛋白酶,合肥博美生物科技有限责任公司;1,1-二苯基-2-苦基肼自由基,2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐,Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司;2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪,Adamas(上海)贸易有限公司;NaOH、浓盐酸、浓硫酸、石油醚、无水乙醇等均为分析纯。
Kjeltec TM 2 300型蛋白自动分析仪,丹麦FOSS公司;BioTek全自动酶标仪,美国Bio-Tek公司;JY99LLDN超声波细胞粉碎仪,宁波新芝生物科技股份有限公司;3K30台式高速冷冻离心机,德国Sigma公司;Delta320精密pH 计,梅特勒-托利多仪器( 上海) 公司;Alpha1-4真空冷冻干燥机,德国Christ公司;日立835-50型高速氨基酸自动分析仪,日本日立公司;SHZ·82A水浴恒温振荡器,精达仪器制造有限公司;LC-20AD高效液相色谱仪,日本岛津SHINADZU公司;IRAffinity-1红外光谱仪,日本岛津SHINADZU公司。
1.2 龙须菜蛋白制备工艺
称取适量龙须菜粉末,按照一定液固比加入NaOH,在适当条件下采用超声辅助碱提法处理,得到粗提取液在10 000 r·min,4 ℃下离心15 min,取上清液,即为龙须菜蛋白质提取液,测定蛋白含量,并计算龙须菜蛋白提取率。之后用0.1 mol·LHCl调节pH至蛋白质等电点,静置2 h后在10 000 r·min,4 ℃下离心15 min,收集沉淀,加超纯水溶解,用0.1 mol·LNaOH调pH至中性,透析脱盐,冷冻干燥得龙须菜粗蛋白,-20 ℃下密封保存。
1.2.1 单因素实验
以蛋白质提取率为指标,分别研究超声功率、超声时间、液固比和碱浓度4个因素对蛋白质提取效果的影响。蛋白质提取的因素设置为以下水平:固定超声温度30 ℃,超声时间70 min,碱浓度0.2 mol·L,液固比25∶1 (mL·g),考察不同的超声功率300、400、500、600、700 W对蛋白质提取率的影响;固定超声温度30 ℃,超声功率500 W,碱浓度0.2 mol·L,液固比25∶1 (mL·g),考察不同超声时间40、50、60、70、80 min对蛋白提取率的影响;固定超声温度30 ℃,超声时间70 min,超声功率500 W,碱浓度0.2 mol·L,考察不同的液固比15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 (mL·g)对蛋白提取率的影响;固定超声温度30 ℃,超声时间70 min,超声功率500 W,液固比25∶1 (mL·g),考察不同的碱浓度0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol·L对蛋白提取率的影响。每组实验3次平行,结果依据SPSS软件进行单因素方差分析和多重比较分析,得到显著性因素。
1.2.2 响应面优化实验
利用Design-Expert 10.0.3软件中的Box-behnken design(BBD)设计原理采取合理的实验设计实施相应曲面法。超声功率、液固比、超声时间和碱浓度(由单因素实验确定)作为实验因素,-1、0、1分别代表各因素的三个水平,共设计出29组实验。以龙须菜蛋白提取率为响应值。实验水平因素见表1。
表1 因素水平编码表
1.3 酶解产物的制备
称取一定质量的龙须菜粗蛋白质,以料液比为1∶50(g·mL)比例加入超纯水,根据表2的实验条件调节pH和温度,分别按3%的加酶量加入5种酶,水浴振荡酶解4 h,酶解完成后煮沸灭酶20 min,冷却,10 000 r·min,4 ℃下离心15 min,取上清液,即为龙须菜蛋白酶解液,冷冻干燥后得龙须菜酶解产物,-20 ℃下密封保存。
表2 龙须菜蛋白酶解条件
1.4 抗氧化活性测定
1.4.1 铁离子还原能力(FRAP)
测定方法参考文献[12],制备FRAP工作液,含0.3 mol·L醋酸盐缓冲液(pH 3.6)、0.01 mol·L2,4,6-三吡啶-S-三嗪[TPTZ]、0.02 mol·LFeCl·6HO 10∶1∶1,现配现用。本实验依据不同浓度的FeSO标准液(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L)与FRAP工作液反应后测得的吸光度制作标准曲线。所得回归方程为=0232 3+0001 2,=0.996,线性良好。
在0.1 mL 2 mg·mL待测样品中加入1.8 mL FRAP工作液,并用蒸馏水补足至5 mL,混匀,37 ℃下反应30 min,593 nm处读出吸光度。同时以0.1 mL蒸馏水作空白对照。所有实验3组平行。计算铁离子还原能力。
1.4.2 DPPH自由基清除能力
测定方法参考文献[13],将1 mL 2 mg·mL待测样品与1 mL 100 μmol·LDPPH溶液(无水乙醇作为溶剂)混合均匀,暗室孵育30 min(室温)。于517 nm处测得吸光度。所有实验3组平行。计算DPPH自由基清除活性。
1.4.3 ABTS自由基清除能力
测定方法参考文献[14],14.8 mmol·LABTS和5.2 mmol·L过硫酸钾1∶1混合并在黑暗条件下反应12 h制备ABTS工作液。在734 nm处用无水乙醇稀释上述制得的工作液以获得1.1±0.02的吸光度。用50 μL 2 mg·mL待测样品与950 μL ABTS试剂混合,黑暗条件下静置2 h,并在734 nm处测量上清液的吸光度。所有实验3组平行。计算ABTS自由基清除活性。
1.5 基础特性测定
1.5.1 氨基酸分析
精确称取龙须菜蛋白质于密封瓶中,加入6 mol·LHCl,充氮气封瓶,110 ℃下水解22 h,过膜,使用氨基酸自动分析仪进行分析。色氨酸测定用5 mol·LNaOH,在110 ℃下碱解22 h后上机分析。氨基酸评分(AAS)依据FAO/WHO提出的人体必需氨基酸均衡模式进行计算。化学评分(CS)依据中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所提出的鸡蛋蛋白氨基酸评分模式分析计算。
1.5.2 傅里叶红外光谱
取用适量龙须菜蛋白质及酶解产物进行压片,将制备好的样品KBr压片在400~4 000 cm波长范围内扫描。
1.5.3 分子量的测定
采用高效体积排阻色谱法,色谱柱为TSK-GELG2000SWXL(7.8 mm×300 mm),流动相为0.1%三氟乙酸的乙腈和0.1%三氟乙酸的双蒸水,以0.5 mL·min的流速洗脱40 min。将还原性谷胱甘肽(307.3 u)、L-氧化型谷胱甘肽(612.63 u)、杆菌肽(1 422.69 u)、抑肽酶(6 511.83 u)、细胞色素C(12 400 u),用流动相溶解并配制成浓度为2 mg·mL的混合标准溶液,在214 nm的波长下检测。
1.6 数据处理
实验数据使用IBM SPSS Statistics 25.0软件进行单因素方差(One-way ANOVA)的显著性差异分析, 通过LSD法进行单因素多重比较分析。每个试验重复3次,差异显著水平设置为<0.05。采用Origin 2019b软件制图。利用Design-Expert 10.0.3软件进行响应面优化实验设计和实验数据的多元回归拟合分析。红外光谱扫描采用OMNIC软件拟合制图。
2 结果及分析
2.1 不同超声条件对龙须菜蛋白提取率的影响
如图1所示,在超声功率小于500 W的条件下,超声功率的增加会带动空化作用及机械作用的加强,使得分子运动加剧,龙须菜细胞壁被加速破坏,蛋白质溶出加快,所以蛋白质提取率迅速上升;在500 W时蛋白质的提取率达到最大,随后提取率下降可能是因为超声强度过大产生大量的空化气泡无法完全溃灭,空化效率减弱。由单因素方差分析,各处理组之间存在显著性差异(<0.05,图1-A)。因此,后续实验选用500 W。
当超声提取时间从40~70 min增加时,龙须菜蛋白质提取率也在逐渐增加,70 min时的提取率最大。这是超声时间的延长促进了蛋白质的溶出,因此,增加了蛋白质的提取率;当提取时间进一步延长到大于70 min后,提取率出现了下降,这可能是由于超声波将龙须菜细胞中的酶溶出,部分之前溶出的蛋白质被酶降解,从而造成蛋白质提取率下降。由单因素方差分析,各处理组之间存在显著性差异(<0.05,图1-B)。因此,后续实验选用70 min的超声时间。
当液固比从15∶1(mL·g)增加至25∶1(mL·g),随着溶剂的量逐渐加大,龙须菜蛋白质提取率迅速增加,液固比为25∶1(mL·g)时蛋白质的提取率最大。这是因为液固比逐渐增加会让溶液黏度变低,使分子扩散速率加快,此时体系内各物质分散均匀,可以很好地促进龙须菜蛋白质的溶出。然而继续增加溶剂的量,蛋白质提取率出现了缓慢下降的趋势,可能是由于内容物的大量溶出导致溶液黏度升高,分子扩散速率变缓,导致蛋白质提取率效果不理想。由单因素方差分析,各处理组之间存在显著性差异(<0.05,图1-C)。因此,后续实验选用25∶1(mL·g)的液固比。
随着碱浓度增加,龙须菜蛋白提取率不断增加,碱浓度为0.2 mol·L时的蛋白质提取率最高。这是由于碱浓度的增加,龙须菜的致密结构松散程度变大,同时促进了氨基酸极性基团的解离程度,使其表面具有同样的电荷,增加溶出效果。另外蛋白质分子上的氨根离子也会被电离,使游离蛋白质增加,大多数水溶性蛋白的溶解程度也会加大。但是碱浓度偏高的情况下会使蛋白质发生变性,蛋白质的高级结构遭到破坏,分子内部疏水性基团被暴露,蛋白质的溶解性降低,有蛋白沉淀生成(脱氨脱羧反应的结果),这也是碱浓度逐渐加大后蛋白质提取率下降的原因。由单因素方差分析,各处理组之间存在显著性差异(<0.05,图1-D)。因此,后续实验选用0.2 mol·L的碱浓度。
点线图上无相同小写字母的表示各处理间差异显著(P<0.05)。
2.2 响应面分析
2.2.1 实验方案设计与显著性分析
以龙须菜蛋白提取率为值,碱浓度(A)、液固比(B)、超声时间(C)、超声功率(D)为自变量,根据Design-Expert 10.0.3软件对实验结果分析拟合后得出四元二次回归模型方程
(%)=74.52-1.47A-2.19B+0.96C-1.01D+1.42AB+1.97AC-0.17AD+3.43BC+6.03BD-5.06CD-3.47A-6.33B-9.25C-7.21D。
表3 模型回归方程方差分析
2.2.2 响应面优化及工艺验证
经Design-Expert 10.0.3软件对碱浓度(A)、液固比(B)、超声时间(C)、超声功率(D)的交互作用进行分析,得到响应面3D图及等高线图,该图组可反映各因素及其交互作用对龙须菜蛋白提取率的影响。具体如图2-图4所示。
图2 液固比与超声时间交互作用的响应面3D图及等高线图
图3 液固比与超声功率交互作用的响应面3D图及等高线图
图4 超声时间与超声功率交互作用的响应面3D图及等高线图
由Design-Expert 10.0.3软件分析得到龙须菜蛋白质的最优提取工艺为碱浓度0.19 mol·L、液固比23.94∶1(mL·g)、超声时间70.46 min、超声功率482.22 W,此条件下的提取率预测值为75.14%。根据实际操作可行性,龙须菜蛋白提取工艺条件调整为碱浓度0.2 mol·L、液固比24∶1(mL·g)、超声时间70 min、超声功率482 W,3次平行试验后得到龙须菜蛋白提取率为(73.78±1.36)%,与理论值比较接近,表明此响应面模型优化得到的龙须菜蛋白提取工艺可靠,可将其应用于实践中。
2.3 龙须菜蛋白质氨基酸分析
由表4可知,龙须菜蛋白质中包含了人体所需的8种必需氨基酸。其中Glu、Cys含量较高,Asp、Leu的含量次之。必需氨基酸占比为36.71%,非必需氨基酸占比为63.29%,这与FAO/WHO理想氨基酸标准接近,表明龙须菜蛋白质氨基酸组成合理。同时采用FAO/WHO联合推荐的必需氨基酸模式和鸡蛋蛋白模式评估蛋白质营养价值。赖氨酸为第一限制性氨基酸。龙须菜蛋白质中的Val、Met、Leu、Phe+Tyr、Ile、Thr均高于FAO/WHO氨基酸标准模式;Val、Leu、Phe+Tyr、Ile、Thr高于鸡蛋蛋白氨基酸模式,表明龙须菜蛋白质氨基酸组成符合人体需求模式,是一种理想植物蛋白源。
表4 龙须菜蛋白氨基酸组成及必需氨基酸分析
2.4 龙须菜蛋白质酶解产物特性分析
2.4.1 抗氧化能力
龙须菜蛋白质经不同蛋白酶水解后其酶解产物抗氧化活性如图5所示。由图5可知,提取得到的龙须菜蛋白质质量浓度为2 mg·mL时,其铁离子还原能力(FRAP)、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清率分别为51.58 μg·mL、40.67%、50.10%。这与蔡苗苗等的实验结果接近,其对超声辅助水提法提取出的舌状蜈蚣藻()粗蛋白质进行抗氧化活性测定,结果表明其还原力、DPPH自由基清除能力及 ABTS自由基清除能力均存在剂量依赖,证明藻类蛋白具有一定抗氧化活性。龙须菜蛋白质经不同蛋白酶水解后,其抗氧化活性均有不同程度的提升。当酶解产物质量浓度为2 mg·mL时,碱性蛋白酶的龙须菜酶解产物DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和铁离子还原能力(FRAP)均显著高于其他4种蛋白酶的酶解产物和同浓度下的龙须菜蛋白质。这与陈洪彬等对龙须菜多肽的体外抗氧化活性研究结果相近,表明龙须菜抗氧化肽具有一定清除DPPH自由基能力和还原力。酶解产物抗氧化活性的提高可能是由于大分子物质在与自由基反应时会存在较大的空间位阻,导致抗氧化活性低下。而经进一步酶解后,大分子蛋白质在酶的作用下被剪切为更小的肽片段,能够与自由基充分反应。
酶种类E1、E2、E3、E4、E5分别为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、植物蛋白复合酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶,P表示龙须菜蛋白质。柱状图上无相同小写字母的表示各处理间差异显著(P <0.05)。
2.4.2 分子量分布分析
龙须菜蛋白质不同酶解产物的分子量分布如表5所示。由表5可知,在龙须菜蛋白质5种酶解产物中,分子量<1 500 u的组分占比均可达到50%以上,其中木瓜蛋白酶酶解产物其分子量>5 000 u的组分含量最多,而胃蛋白酶酶解产物<500 u的组分含量最多。Chai等的研究表明,大多数抗氧化肽的分子量在500~1 800 u,且通常认为分子量较小的肽抗氧化活性较好。同时Aleman等的研究表明,酶解产物分子量过小可能会因含有大量的游离氨基酸而使其抗氧化活性降低。在龙须菜蛋白质不同酶解产物中,碱性蛋白酶酶解产物其分子量在500~1 500 u组分含量均高于其他4种酶解产物,其酶解产物抗氧化活性也最高。
表5 酶解产物的分子量分布
2.5 傅里叶红外光谱分析
龙须菜蛋白质及其碱性蛋白酶酶解后产物的傅里叶红外光谱见图6。由图6所示,酶解产物的图谱相对于蛋白质而言发生了一定迁移。两种物质的红外光谱由酰胺A、B和酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带组成。酰胺A带处于波长3 300~3 340 cm,反映了N-H与O-H中氢键的伸缩振动吸收。位于1 600~1 660 cm波长范围内的酰胺Ⅰ带是C=O键的特征谱带, 能够有效地反映三螺旋结构。酰胺Ⅰ带对分子几何结构和氢键模式的微小变化非常敏感,因此每种类型的二级结构都会产生不同的C=O拉伸频率。从图谱中可以看出,龙须菜蛋白质在1 645 cm有强烈的伸缩振动,酶解产物则迁移到1 649 cm处发生伸缩振动,表明蛋白质具有更为完整的三螺旋结构。酰胺Ⅱ带中1 530~1 510 cm区域与1 550~1 530 cm区域分别表明反平行β-折叠结构与平行β-折叠结构的存在,龙须菜蛋白质在1 537 cm处具有吸收峰,表明龙须菜蛋白质存在平行β-折叠结构;酶解产物在1 511 cm处具有吸收峰,表明酶解产物有反平行β-折叠结构存在。龙须菜蛋白质在1 030 cm处产生强烈的吸收峰,极可能是由于C-N键发生的伸缩振动。红外光谱分析初步表明,龙须菜蛋白质经碱性蛋白酶酶解后结构发生了一定变化,蛋白质中完整的三螺旋结构被水解破坏,平行β-折叠结构转变为反平行β-折叠结构,结构的变化可能会将蛋白质中原本被紧密包裹的活性基团暴露,使得酶解产物更易被自由基夺取电子,具备更好的抗氧化能力。
图6 龙须菜蛋白与酶解产物红外光谱扫描图
3 结论
本研究以龙须菜为原料,采用超声辅助碱提酸沉法制备龙须菜蛋白质,在单因素实验的前提下,运用响应面法对龙须菜蛋白质的提取工艺进行优化,建立了方程拟合度良好且显著的响应面模型。研究得到龙须菜蛋白质的最佳提取工艺条件为碱浓度0.2 mol·L、液固比24∶1(mL·g)、超声时间70 min、超声功率482 W,实际提取率达到73.78%与理论值大致相近。对龙须菜蛋白质进行氨基酸分析结果表明,龙须菜蛋白是一种优质理想的植物蛋白源。此外,分别采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、植物蛋白复合酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶对龙须菜蛋白质进行了酶解。该5种酶解产物在抗氧化活性和分子量分布上均呈现出一定差异。总的来说,龙须菜蛋白酶解物的抗氧化活性均高于同浓度下的龙须菜蛋白,且碱性蛋白酶酶解产物的抗氧化活性最高,其分子量主要集中在1 500 u以下。傅里叶红外光谱扫描表明龙须菜蛋白与其酶解物具有不同结构特性。本文可为龙须菜蛋白的提取及高值化利用提供一定参考。