丛枝菌根真菌改善镉胁迫下植物根系和土壤微环境的效应

杜 红，李玉鹏，程 文，肖荣英，胡 鹏

(1.河南农业职业学院 农业工程学院，河南 郑州 451450； 2.南阳市农业科学院 小麦研究中心，河南 南阳 473000； 3.安徽省农业科学院 土壤肥料研究所，养分循环与资源环境安徽省重点实验室，安徽 合肥 230031； 4.信阳农林学院 农学院，河南 信阳 464000； 5.华中农业大学 资源与环境学院，华中农业大学微量元素研究中心，湖北 武汉 430070)

城市化进程加快、工业生产活动增加、农药化肥不合理使用，以及采矿废水灌溉等问题导致土壤重金属含量显著增加，对农业的可持续性发展造成极大影响。重金属Cd因污染面广、持续期长、降解率低等特性，在土壤重金属污染领域备受关注。研究发现，Cd污染不仅会引起土壤板结，影响N、P、K元素的保持和供应，还会危害土壤酶活性和微生物环境平衡，显著抑制植物根系生长发育。试验表明，当土壤中的Cd浓度为6 mg·kg时，对土壤真菌有显著的刺激作用，但对细菌、放线菌、微生物总数则表现出抑制作用，且随Cd浓度增加，其抑制作用逐渐增强，土壤脱氢酶、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶活性相应降低。何俊瑜等研究发现，不同浓度Cd对水稻幼苗根系形态和根系活力的影响不尽相同：低浓度时，对水稻总根长、根表面积、根体积、根干重、根系活力无明显影响；但在高浓度下，则表现出一定的抑制效应。目前，关于Cd胁迫下植物光合生理变化、Cd富集吸收，以及植物耐受性等方面的研究较多，但涉及植物根系和土壤微生物环境等的研究还相对较少。

丛枝菌根真菌(AMF)是一类土壤有益微生物，能够与植物协同建立共生关系，改善土壤条件，促进植物生长发育，提高生物有机体抗性，加速建立健康的土壤生态系统。研究发现，接种摩西斗管囊霉()可使Cd胁迫下旱稻()根际土壤脲酶、蔗糖酶活性显著提高(增幅9.6%～44.5%)，极大地促进根际土壤碳、氮循环，并显著提高旱稻根系生物量，但其效果随镉污染程度增加而显著减弱。镉胁迫下，向芦苇()和狼尾草[((L.) Spreng.)]接种摩西斗管囊霉、根内根孢囊霉()后，根系干质量显著增加，但上述AMF的侵染率随镉浓度增加而降低。廖继佩等以玉米()为供试植物，发现不同浓度镉处理下，接种光壁无梗囊霉()、苏格兰球囊霉()、木薯球囊霉()可显著增加土壤中放线菌的数量，但随Cd浓度增大，土壤中的放线菌数量变少，且接种上述AMF有利于提高土壤磷酸酶活性。

本研究以多年生黑麦草()为对象，探究Cd污染条件下接种AMF[变形球囊霉()]对黑麦草根系构型、土壤酶活性，以及微生物群落等的影响，以期为利用AMF增强植物对重金属Cd的抗性提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物材料为多年生黑麦草品种卡特，种子购自安徽良龙种业科技有限公司。黑麦草种子经过氧化氢溶液浸泡10 min后，用无菌蒸馏水冲洗表面，消毒备用。

供试AMF菌种为变形球囊霉()，购自丛枝菌根真菌种质资源库。接种物为孢子、侵染根段、外生菌丝和培养基质的混合物。

栽培基质为壤土，基本理化性质如下：pH值7.04，含盐量0.12%，有效磷66.7 mg·kg，全氮89.4 mg·kg，速效钾37.8 mg·kg，有机质1.9%。风干后，过1 cm筛，经高压蒸汽灭菌(120 ℃，2 h)后备用。

试验用的花盆(规格为25 cm×18 cm×18 cm)经0.5%(质量分数)高锰酸钾溶液消毒1 h后使用。每盆装3.5 kg栽培基质(约至盆体积的2/3处)。

1.2 试验设计

围绕是否接种AMF(接种处理标记为AMF，不接种处理标记为NM)和Cd浓度开展双因素试验，其中，Cd浓度分别设置为0、10、20、30 mg·kg，共计8个处理，每个处理重复3次，随机排列。

不同浓度Cd处理，以CdCl溶液的形式添加到土壤，静置7 d后测定土壤Cd浓度，以此重复，直到试验设计水平。AMF的接种剂量为50 g(每1 g含80个孢子)，NM处理接种等量灭菌接种物。接种后，加入基质覆盖，灌水浇透。

将多年生黑麦草种子播于花盆，每盆播种50粒种子，覆膜保湿，放于人工气候室(昼夜光照各12 h，昼夜温度分别为25、18 ℃，平均相对湿度70%)内培养。出苗后，每周浇水1次，5～10 d浇1次Hoagland营养液(300 mL)，保持水分在70%左右。培养3个月后取样，用于各项指标的测定。

1.3 指标测定

用米尺测定黑麦草根茎部到植株生长点的距离作为株高。植株地上部分收获后，用水洗净、擦干，105 ℃杀青0.5 h，85 ℃烘至恒重，记录其干重。

采集黑麦草幼嫩根系100 g，洗净后剪成1 cm左右的根段，用FAA固定液[70%(体积分数)乙醇溶液、甲醛、冰醋酸按90∶5∶5的体积比混合]固定24 h。加入3%(质量分数)氢氧化钾溶液100 mL，90 ℃水浴15～30 min(至根系相对透明为止)。洗去碱液后，加入10%(体积分数)HO溶液漂白15 min，用蒸馏水清洗，加入0.2 mol·L盐酸酸化1 h以上，用乳酸甘油染色法计算菌根侵染率。

称取根尖0.5 g，采用氯化三苯基四氮唑系周围(TTC)法测定根系活力。

采集根系周围土壤样本，带回实验室后经风干、磨碎，过5 mm筛，混匀备用。采用稀释平板法测定土壤样本中真菌、细菌和放线菌的数量，采用熏蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳(SMBC)和土壤微生物生物量氮(SMBN)含量，采用高锰酸钾滴定法测定土壤过氧化氢酶活性，采用邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性，采用磷酸苯二钠法测定土壤酸性磷酸酶活性，采用TTC比色法测定土壤脱氢酶活性。采用Bradford法测定球囊霉素相关土壤蛋白[易提取球囊霉素相关土壤蛋白(EE-GRSP)、总球囊霉素相关土壤蛋白(T-GRSP)]含量。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2016软件对数据进行整理和绘图。采用SPSS 20.0软件进行方差分析，对有显著(<0.05)差异的，采用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 接种AMF对Cd胁迫下黑麦草菌根侵染的影响

不同Cd浓度下，AMF均能跟黑麦草根系形成共生结构(图1)。不加Cd的条件下，AMF侵染率最高(53.0%)，菌根中孢子数量最多(15.3 cm)，随Cd浓度增加，AMF侵染率和孢子数量显著(<0.05)降低(表1)。当Cd浓度为0～20 mg·kg时，接种AMF处理的黑麦草株高较不接种处理显著(<0.05)增加；当Cd浓度为0～20 mg·kg时，接种AMF处理的黑麦草地上部干重较不接种处理显著(<0.05)增加。无论是否接种AMF，随Cd浓度增加(0～30 mg·kg)，黑麦草的株高和地上部干重显著(<0.05)下降。方差分析结果显示：是否接种AMF和Cd浓度均对黑麦草株高和地上部干重有极显著(<0.01)影响，但二者交互作用的影响并不显著(>0.05)。

图1 AMF侵染黑麦草根系情况(左图展示菌丝+孢子结构，右图展示根内菌丝)

表1 不同处理下AMF侵染与黑麦草生长情况

2.2 接种AMF对Cd胁迫下黑麦草根系活力的影响

相同Cd浓度下，是否接种AMF对黑麦草根系活力无显著影响(图2)。同一接种处理下，随Cd浓度增加，黑麦草根系活力显著(<0.05)降低。方差分析结果显示，是否接种AMF和Cd浓度均对黑麦草根系活力有极显著(<0.01)影响，但二者交互作用的影响并不显著(>0.05)。

柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。

2.3 接种AMF对Cd胁迫下黑麦草根系构型的影响

相同Cd浓度下，接种AMF的处理较不接种显著(<0.05)增加了黑麦草根系总长度(除20 mg·kgCd浓度外)、根系总投影面积(表2)。同一接种处理下，随Cd浓度增加，黑麦草根系总长度、根系总投影面积、根系总体积、根尖数和根分叉数显著(<0.05)下降。方差分析结果显示：是否接种AMF和Cd浓度均对黑麦草根系总长度、根系总投影面积、根系总体积、根尖数和根分叉数有极显著(<0.01)影响，但二者交互作用的影响并不显著(>0.05)。

表2 不同处理下黑麦草的根系构型

2.4 接种AMF对Cd胁迫下土壤微生物群落组成的影响

相同Cd浓度下，接种AMF的处理较不接种显著(<0.05)增加了土壤中细菌(除30 mg·kgCd浓度外)、真菌(除30 mg·kgCd浓度外)、放线菌(除20 mg·kgCd浓度外)的数量(表3)。同一接种处理下，随Cd浓度增加，土壤中细菌、真菌、放线菌的数量呈显著(<0.05)减少。不加Cd的条件下，接种AMF处理的土壤真菌、细菌与放线菌数量最大，分别为2.51×10g、3.10×10CFU·g和5.17×10g。方差分析结果显示：是否接种AMF对土壤真菌、细菌、放线菌数量有极显著(<0.01)影响；Cd浓度对土壤放线菌数量有极显著(<0.01)影响，对细菌、真菌数量有显著(<0.05)影响；二者交互作用对土壤真菌、细菌数量有极显著(<0.01)影响，对放线菌数量无显著(>0.05)影响。

表3 不同处理下土壤微生物群落组成

2.5 接种AMF对Cd胁迫下土壤微生物生物量碳、氮的影响

不同处理对土壤SMBC、SMBN的影响趋势基本相同(图3)。相同Cd浓度下，接种AMF的处理较不接种显著(<0.05)增加了土壤SMBC含量(除30 mg·kgCd浓度外)，但对土壤SMBN含量无显著影响。同一接种处理下，随Cd浓度增加，土壤SMBC、SMBN含量显著(<0.05)降低，说明其对SMBC、SMBN的抑制作用逐渐增强。方差分析结果显示：是否接种AMF和Cd浓度均对土壤SMBC、SMBN含量有极显著(<0.01)影响，但二者交互作用的影响并不显著(>0.05)。

图3 不同处理下黑麦草根际土微生物生物量碳、氮含量

2.6 接种AMF对Cd胁迫下土壤酶活性的影响

相同Cd浓度(0～20 mg·kg)下，接种AMF的处理较不接种显著(<0.05)增加了土壤中多酚氧化酶的活性；不加Cd时，接种AMF的处理较不接种显著(<0.05)增加了土壤中过氧化氢酶的活性(表4)。同一接种处理下，随Cd浓度增加，土壤中脱氢酶和过氧化氢酶的活性显著(<0.05)增加，而酸性磷酸酶和多酚氧化酶的活性则显著(<0.05)降低。方差分析结果显示：是否接种AMF和Cd浓度均对土壤多酚氧化酶、过氧化氢酶、脱氢酶活性有极显著(<0.01)影响，但二者交互作用的影响不显著(>0.05)；Cd浓度对土壤酸性磷酸酶活性有极显著(<0.01)影响，但是否接种AMF及其与Cd浓度的交互作用对土壤酸性磷酸酶活性的影响不显著(>0.05)。

表4 不同处理下土壤酶活性

2.7 接种AMF对Cd胁迫下土壤中球囊霉素相关土壤蛋白含量的影响

相同Cd浓度下，接种AMF的处理较不接种显著(<0.05)增加了土壤中EE-GRSP(除30 mg·kgCd浓度外)、T-GRSP含量(图4)。接种AMF的处理中，随Cd浓度增加，土壤中EE-GRSP和T-GRSP含量显著(<0.05)降低；不接种处理中，不同Cd浓度处理的土壤中EE-GRSP和T-GRSP含量差异不显著(>0.05)。方差分析结果显示：是否接种AMF及其与Cd浓度的交互作用对土壤中EE-GRSP和T-GRSP含量有极显著(<0.01)影响，但Cd浓度的影响不显著(>0.05)。

图4 不同处理下土壤中球囊霉素相关土壤蛋白含量

3 讨论

AMF是土壤-微生物系统中寄主植物根系与微生物互利共生的结合体。据报道，AMF能与陆地生态系统中90%以上的维管植物建立共生关系，这种菌根共生体能够帮助寄主植物提高其对重金属的耐受力，从而减轻重金属的毒害作用。研究发现，AMF能与花生形成良好的共生关系，Cd处理对其AMF侵染率无显著影响，且接种AMF后花生地上部生物量平均增加13%，花生根系的长度、根系表面积和根系体积也均显著增加。本研究发现，随Cd浓度增加，黑麦草的AMF侵染率显著降低，但接种AMF有助于促进黑麦草的生长，改善植物根系发育。这可能是因为，AMF侵染植物根系表皮细胞后，促进了表皮细胞壁的木质化，进而促进寄主植物根系的发育和分枝，显著改变宿主植物根系形态。张旭红等发现，摩西斗管囊霉能够促进蚕豆()根系发育。本试验也证实了这一点，接种AMF有助于增加黑麦草根系总长度、根系总投影面积、根系总体积、根尖数和根分叉数，提高根系活力。

微生物是土壤生态系统的重要组成部分，直接参与土壤系统的物质、能量循环；因此，微生物(真菌、细菌、放线菌)数量常被用作土壤质量评价的重要指标，尤其是在重金属污染土壤上。廖洁等研究报道，甘蔗盆栽条件下，Cd污染使土壤微生物数量发生显著改变，高浓度时土壤中真菌、细菌和放线菌数量显著下降。但也有研究发现，随Cd浓度增加，稻田土壤细菌数量先增后减，而放线菌和真菌数量则一直减少。本研究发现，Cd胁迫下，黑麦草根系周围土壤中真菌、细菌、放线菌数量都呈减少的趋势。谢宏鑫等发现，西瓜接种AMF后，土壤中的细菌、放线菌数量显著高于对照，而真菌数量显著低于对照。本研究发现，接种AMF后，黑麦草根系真菌、细菌、放线菌数量均显著增加。土壤微生物的数量直接决定SMBC、SMBN含量。研究发现，SMBC、SMBN含量随Cd浓度增加呈下降趋势；另有研究显示，低浓度重金属对土壤SMBC、SMBN起刺激作用，但高浓度时则表现为抑制作用。本试验表明，Cd胁迫下土壤中的SMBC、SMBN含量都显著降低，但接种AMF有助于SMBC、SMBN含量的提高。

在植物-微生物系统中，土壤酶活性受环境胁迫变化较大。高大翔等研究发现，Cd对土壤脲酶、脱氢酶活性具有显著抑制作用，随Cd浓度增加，这些酶的活性显著降低。在本研究中，土壤多酚氧化酶和酸性磷酸酶活性随Cd浓度增加表现出降低的趋势，与前述结果相似。

球囊霉素相关土壤蛋白是AMF侵染—繁殖—衰解周转过程中产生的一种抗性有机质组分，在土壤生态系统中具有重要的潜在生态功能。AMF产生的球囊霉素相关土壤蛋白在土壤中周转时间长，难分解，对土壤有机碳的累积或保存具有重要的作用。本研究发现，接种AMF的处理有助于提高土壤中EE-GRSP和T-GRSP的含量。

综上，AMF能够与黑麦草建立良好的共生关系，促进植物生长，改善植物根系构型，增加根系总长度、根系总投影面积、根系总体积、根尖数和根分叉数，提高根系活力。此外，AMF能够诱导产生较多的球囊霉素相关土壤蛋白，促进土壤微生物生物量碳、氮的积累，提高土壤中过氧化氢酶和多酚氧化酶的活性，增加土壤微生物(真菌、细菌、放线菌)数量，提高对Cd胁迫的抗性。