壮医刺血疗法对失眠大鼠神经递质和下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响▲

2022-05-31陈壮丽张婷婷

广西医学 2022年6期

刘佩钟鸣王丽陈红梁彬陈壮丽张婷婷

(1 广西中医药大学研究生院，南宁市 530022，电子邮箱1069925914@qq.com；2 广西中医药研究院，南宁市 530022；广西中医药研究院3 药理所，4 门诊部，南宁市 530022)

睡眠占据着人类生命时间的1/3，是生命活动的重要组成部分，其受环境、精神、躯体疾病、药物、心理等多种因素影响。失眠是以频繁的入睡困难、睡眠难以维持为主要症状，症状超过1个月、频率每周≥3 次，且影响日间功能活动的睡眠障碍[1]。良好的睡眠质量是维持健康的基本保障[2]。然而，现代社会生活节奏紧张、各种压力增大，失眠发病率越来越高，全世界失眠患病率为10%～20%[3]。

壮医刺血疗法是用刺血针浅刺人体穴位、病理反应点或浅表血络，再通过挤压或拔罐放出适量血液，从而由表达里疏通龙路、火路气机，达到治病目的的一种民族特色外治法[4]。陈红等[5]研究发现，壮医刺血疗法对失眠恶性循环具有抑制作用。5-羟色胺是参与调节多种生理反应的重要神经递质，参与并维持慢波睡眠。陈红等[6]进一步观察壮医穴位刺血疗法治疗实热型失眠症患者的临床疗效，结果显示壮医穴位刺血疗法可提高血浆5-羟色胺含量、降低去甲肾上腺素含量，有效地缓解失眠症状。腹腔注射对氯苯丙氨酸(para-chlorophenylalanine,PCPA)可阻断5-羟色胺合成，是目前建立失眠动物模型较为常用的方法，具有操作较简单、成功率高、成本相对较低、可重复性好等特点[7]。因此，本文通过腹腔注射 PCPA建立失眠大鼠模型，探讨壮医刺血疗法改善失眠的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物无特定病原体级SD大鼠40只(雌雄各半)，体重(200±20)g，7周龄，由广西医科大学动物实验中心提供(许可证号：SCXK桂2020-0003)。实验在广西中医药研究院动物实验中心进行，动物饲养房温度为24℃～26℃，给予足够水和饲料，动物自由饮水与进食，适应性饲养1周后开始正式实验。

1.2 主要试剂与仪器地西泮片由上海上药信谊药厂有限公司生产(批号：14210101)，PCPA由美国Sigma 公司生产(批号：OK201412Y)，大鼠5羟色胺ELISA试剂盒(货号：MM-0442R1)、大鼠去甲肾上腺素(norepin-ephrine，NE)ELISA试剂盒(货号：MM-20302R1)、大鼠促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)ELISA试剂盒(货号：MM-0520R1)、大鼠促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)ELISA试剂盒(批号：202007)、大鼠皮质醇ELISA试剂盒(批号：202107)均购于广州康凯信生物科技有限公司，一次性无菌针灸针(25 mm×13 mm)购自吴江市云龙医疗器械有限公司(批号：W2105024)。全波长全自动多功能酶标仪Multiskan GO购自赛默飞世尔公司，高速台式离心机TGL-16B购自上海安亭科学仪器厂。

1.3 失眠模型的建立依据随机数字表法将40只大鼠分为空白组、模型组、壮医刺血组、西药组，每组10只(雌雄各半)，雌雄分笼、分组饲养，5只/笼。除空白组外，均采用腹腔注射PCPA混悬液建立失眠模型[8]：取适量碳酸氢钠片溶于30℃～40℃温水中，配成浓度为5%的碳酸氢钠水溶液，将其缓慢滴入生理盐水中，滴加的同时用pH试纸测试酸碱度至7～8之间，制备成弱碱性生理盐水，将PCPA加入弱碱性生理盐水中，并加入阿拉伯胶搅拌使其浓度为10%，超声波处理20 min，配置PCPA混悬液浓度为50 mg/mL。大鼠用药量为1 mL/100 g，1次/d，注射2 d。末次腹腔注射28～30 h后如大鼠出现睡眠昼夜节律消失、白天活动增加、体重增长缓慢、毛发无光泽且攻击性强等与空白组大鼠明显不同的表现，即提示造模成功[9]。注射PCPA混悬液后30 min内，大鼠状态安静，观察到腹部微微扭转爬行，30 min后恢复正常；造模后观察12 h，造模的3组大鼠频繁双脚站立，攀爬笼盖、互相扑倒，静卧时间远远短于空白组，感受到灯光、声音刺激警觉性增强，呈攻击状态，开始打斗，耳朵尾巴可见伤痕，30只大鼠均建模成功。

1.4 治疗方法造模成功后连续治疗干预12 d。空白组：每日定时抓放大鼠。模型组：给予生理盐水10 mL/kg灌胃，1次/d。壮医刺血组：参照《实验针灸学》[10]穴位图谱定位，取大鼠大椎、至阳、心俞、肝俞穴位，剃毛、常规消毒后用浅刺针点刺后挤压放血，1滴/穴，1次/2 d，共治疗6次。西药组：给予地西泮灌胃，使用前用生理盐水稀释至0.092 mg/mL，按10 mL/kg给药，1次/d。

1.5 体重测量建模第1天记录大鼠基础体重，治疗干预结束后次日，取材前再次称重，计算各组大鼠治疗前后体重增长情况。

1.6 取材及指标检测由于机体受到刺激首先反映到下丘脑CRH神经元，因此检测下丘脑-垂体-肾上腺轴相关激素时，选择下丘脑组织标本，其他激素则选择血清标本。自开始造模的第14日20点禁食禁水，治疗干预结束后次日，9点处死各组大鼠，腹主动脉取血5 mL，转存至-80℃冰箱待测，检测时，血液自然放置10～20 min，3 000 r/min离心15 min，仔细收集上清液至新的PC管备用，采用ELISA法检测血清皮质醇、ACTH含量。大鼠断头取脑冰上分离下丘脑，按1 g ∶30 mL的比例加入一定量的磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)，手工将标本充分匀浆，3 000 r/min离心10 min，仔细收集上清液，存放于-80℃冰箱待检，采用ELISA法检测大鼠下丘脑5-羟色胺、NE、CRH含量。均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.7 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，若方差齐组间比较采用单因素方差分析，多重两两比较采用LSD-t检验，若方差不齐校正方差后，采用方差分析；若不符合正态分布，用中位数(四分位距)表示，比较采用非参数秩和H检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 干预后4组大鼠的一般状态的比较模型组与空白组大鼠状态持续差异明显。干预结束后次日，壮医刺血组和西药组大鼠昼夜节律基本恢复正常，对光、声音敏感度下降，活动度、激惹度相比模型组减弱，狂躁状态减轻，静卧时间增加。

2.2 干预后4组大鼠的体重增长情况的比较 4组大鼠干预前后体重增长幅度差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 干预后4组大鼠体重增长情况的比较[M(Q),g]

2.3 干预后4组大鼠下丘脑组织中的神经递质含量的比较与空白组相比，模型组大鼠下丘脑内 5-羟色胺含量降低，而NE含量升高(均P<0.05)；与模型组相比较，西药组、壮医刺血组大鼠下丘脑内 5-羟色胺含量升高，而NE含量降低(均P<0.05)；西药组和壮医刺血组大鼠下丘脑内5-羟色胺和NE的含量比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 干预后4组大鼠下丘脑5-羟色胺和NE含量的比较(x±s，ng/mL)

2.4 干预后4组大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴相关激素的含量的比较与空白组相比，模型组大鼠下丘脑内CRH和血清皮质醇、ACTH含量均升高(均P<0.05)；与模型组相比，壮医刺血组和西药组大鼠下丘脑内CRH和血清皮质醇、ACTH含量均下降(均P<0.05)；与西药组相比，壮医刺血组下丘脑内CRH含量和血清皮质醇含量均降低(均P<0.05)。见表3。

3 讨论

壮医刺血疗法是具有壮医特色的外治法之一，是广西壮族地区家族代代相传、使用甚广的一种古老疗法，其形成和发展受壮民生活习惯、文化习俗、气候地理环境的影响，具有显著的壮族民族和地域特点，是壮医学的重要组成部分。壮医称失眠为“年闹诺”“夜不寐”“巧坞病”，壮语中“年”为睡之意，“闹”为不的意思，“年闹诺”意译为睡不着。壮医将失眠的病机概括为阴阳失衡论、三气不同步论、三道两路不通论、脏腑骨肉失调论、气血失衡论、毒虚致病论六大理论。思虑过度、情志内伤、胃失和降伤及心和咪隆(脾)，以及巧坞(大脑)失养或惊恐、房劳伤及咪腰(肾)，均可导致心火炽盛、心肾不交、阴阳不调的失眠[11]。从壮医学理论来看，壮医刺血疗法依据“血实宜决之”“治其病必先去其血”的治疗原则，调补气血、通调三道两路、平衡阴阳的治疗原理，可对失眠起到实则泻之、恢复阴阳平衡的治疗作用；现代研究也表明，壮医刺血疗法通过刺激体表微血管管壁神经而改善微血管循环功能，从而加强机体组织器官的功能,提升免疫机能，促进神经功能修复，增强抗应激能力[12-14]。由此可见，壮医刺血疗法可用于治疗失眠。已有学者基于壮医刺血平衡阴阳、激发调畅人体气血、畅通三道两路、同步三气的治疗原理，采用壮医刺血疗法治疗失眠，并获得一定的临床效果[15]。本研究结果也显示，干预结束后，壮医刺血组大鼠的昼夜节律基本恢复正常，由失眠引起的不良症状也有所减轻，表明壮医刺血疗法治疗失眠具有较好的效果。

5-羟色胺是一种可以改变人体生理功能如睡眠、食欲等的重要神经递质。5-羟色胺能神经元对睡眠觉醒有双向调节作用,是非快速眼动睡眠的必备条件，既能促进觉醒，又能协同NE触发快速眼动睡眠[16]。有研究显示，失眠模型大鼠脑内的5-羟色胺水平已低于正常水平，故5-羟色胺是睡眠与觉醒的关键枢纽之一[17]。NE与觉醒呈正相关，NE水平低则睡眠觉醒少[18]。本研究结果显示，与空白组相比，模型组大鼠下丘脑内5-羟色胺含量降低，而NE含量升高(均P<0.05)，符合上述失眠引起的神经递质含量变化。人是一个有机整体，体内也蕴藏着天地人三部之气，“巧坞”位于人体上部属天，主宰全身各脏腑器官活动，调控人的视听嗅觉和思维感觉，故神志思维方面的疾病都与“巧坞”密切相关[19]。本研究中，与模型组相比较，西药组、壮医刺血组大鼠下丘脑内5-羟色胺含量升高，而NE含量降低(均P<0.05)。这提示壮医刺血疗法可以调节5羟色胺和NE等神经递质，从而减少觉醒时间，改善失眠状态，恢复“巧坞”正常生理功能，与西药地西泮效果相当。这一研究结果与陈红等[5]临床观察结论相似。

下丘脑-垂体-肾上腺神经内分泌系统是最原始的内源性昼夜节律调节系统，其活动受视交叉上核的调节，是机体对应激刺激的反应中枢[20]。当机体受到内源性或外源性刺激时，会将刺激反应信息汇聚于下丘脑为CRH神经元，兴奋下丘脑-垂体-肾上腺轴，进而引起垂体-肾上腺皮质系统发生反应[21]，随即杏仁核被激活，CRH分泌增加，ACTH和皮质醇的含量也随之增加，从而导致觉醒效应[22]。本研究显示，与空白组相比，模型组大鼠下丘脑内CRH和血清皮质醇、ACTH含量均升高(均P<0.05)，失眠大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴相关激素的变化符合上述描述。本研究结果还显示，与模型组相比，壮医刺血组和西药组大鼠下丘脑内CRH和血清皮质醇、ACTH含量均下降(均P<0.05)。这表明壮医刺血疗法治疗失眠，可能与其缓解下丘脑-垂体-肾上腺轴过激现象，从而降低下丘脑内CRH和血清皮质醇、ACTH激素水平有关。