急性缺血性脑卒中患者外周血LINC00342相对表达水平及其与临床特征的关系▲

朱路路 吴旭龙 赵 直 徐冰一 赵心怡 古 联 苏 莉

(1 广西医科大学公共卫生学院，南宁市 530021，电子邮箱:zhululu0714@163.com；2 广西中医药大学第一附属医院脑病科，南宁市 530023)

全球疾病负担数据显示，2019年脑卒中的伤残调整寿命年为1.43亿年，死亡病例数量达655万[1]。而缺血性脑卒中是脑卒中的主要类型，占脑卒中病例的77.8%[2]。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码转录本，lncRNA虽然不能编码蛋白，但能与DNA、其他RNA、蛋白相互作用而发挥生物学功能。脑组织和血液中lncRNA表达的变化，可能在缺血性脑卒中的病理生理过程中发挥重要作用[3]。lncRNA具有显著的组织特异性，其功能包括通过顺式和反式机制调节染色质拓扑结构、蛋白质和其他RNA支架，充当蛋白质和RNA的诱饵，调节邻近基因并产生微肽[4]。目前已有研究初步探讨了lncRNA在缺血性脑卒中发生和发展中的作用，如MALAT1[5]、PVT1[6]均可通过竞争性抑制微小RNA与靶基因信使RNA的结合,发挥对微小RNA和靶基因的调控作用,从而参与缺血性脑卒中的病理过程。LINC00342位于染色体2q11.1，为一种lncRNA。目前尚无LINC00342与缺血性脑卒中的相关研究。本研究采用实时荧光定量PCR技术测定急性缺血性脑卒中患者的外周血LINC00342相对表达水平，初步探讨外周血LINC00342相对表达水平与急性缺血性脑卒中发生及患者临床特征的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入于2015年12月至2019年11月期间在广西中医药大学第一附属医院住院诊治的90例急性缺血性脑卒中患者作为病例组。纳入标准：符合《各类脑血管疾病诊断要点(1995)》[7]中急性缺血性脑卒中的相关诊断标准，且经头颅CT和/或MRI明确诊断，均由2名主治及以上职称的神经内科医师进行诊断；起病72 h之内入院；患者入院前没有接受过急性缺血性脑卒中相关治疗。排除标准：合并严重肝肾功能不全、造血功能障碍、重度休克的患者；由动脉炎、肿瘤、脑外伤、脑血管畸形、药物等引起的脑卒中患者。选择同期在广西南宁市青秀区2家社区卫生服务中心体检的90例健康体检者作为对照组。入选标准：无脑卒中、冠心病等心脑血管疾病病史，无自身免疫性疾病、肝肾功能不全和恶性疾病。病例组中男性43例、女性47例，患者年龄(65.89±11.25)岁；对照组中男性43例、女性47例，年龄(67.23±7.29)岁。两组年龄、性别分布差异均无统计学意义(t=0.952，P=0.343；χ2=0.000，P=1.000)。本研究已获广西中医药大学医学伦理委员会审查批准，所有研究对象知情后签署知情同意书。

1.2 血糖和血脂、血压指标的检测 于入院后第2天清晨，采用非抗凝真空采血管采集急性缺血性脑卒中患者清晨空腹血和餐后2 h静脉血各2 mL，使用日立7600全自动生化分析仪检测空腹血糖、餐后2 h葡萄糖(2-hour postprandial blood glucose,2hPBG)、总胆固醇、三酰甘油、HDL、LDL、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)水平。在患者入院时使用电子血压计测量其血压水平。

1.3 实时荧光定量PCR检测外周血LINC00342的相对表达水平 采用含乙二胺四乙酸抗凝剂的真空采血管采集研究对象禁食后次日清晨外周静脉血5 mL(病例组为入院次日采集)。采用TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司，货号：15596026)提取血液样本RNA。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa公司，货号：RR047A)将RNA反转录成cDNA，严格按照说明书步骤操作。目的基因LINC00342和内参基因β-肌动蛋白的引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。LINC00342上游引物序列为5′-AAAAGTCCCCACGAAAACC-3′，下游引物序列为5′-TTCATCCATCTCAACCTCCTC-3′；β-肌动蛋白上游引物序列为 5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′，下游引物序列为5′-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3′。使用TB Green® Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus，TaKaRa公司，货号：RR820A)进行PCR反应。反应体系为20 μL，包括10 μL TB Green® Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)、0.8 μL上游引物、0.8 μL下游引物、0.4 μL ROX Reference Dye、2 μL样本、6 μL 灭菌水。反应条件如下：预变性，95℃(30 s)；变性，94℃(5 s)；退火、延伸，95℃(15 s)→60℃(34 s)，40个循环；95℃(15 s)→60℃(1 min)→95℃(15 s)。得到每个样本对应的目的基因LINC00342和内参基因β-肌动蛋白的Ct值后，以2-ΔCt公式计算LINC00342的相对表达水平。委托生工生物工程(上海)股份有限公司对扩增出的产物进行测序，以验证该引物序列是否能够特异性地扩增出目的基因LINC00342序列。

1.4 统计学分析 使用R语言软件(R 3.6.3版本)进行统计分析。计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料以[M(P25，P75)]表示，组间比较采用秩和检验。以P<0.05视为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 病例组和对照组外周血LINC00342相对表达水平的比较 对扩增出的产物进行测序，结果表明本研究设计的产物序列能够特异性地扩增出LINC00342序列(见图1)。对照组、病例组的外周血LINC00342相对表达水平分别为0.005(0.003，0.011)、0.003(0.002，0.007)，病例组外周血LINC00342相对表达水平低于对照组(W=3 008.537，P=0.003)。

图1 LINC00342的PCR产物测序序列图

2.2 不同外周血LINC00342相对表达水平的急性缺血性脑卒中患者的血压、血糖、血脂水平的比较 病例组患者外周血LINC00342的相对表达水平不符合正态分布，以病例组外周血LINC00342的相对表达水平的中位数(3.07×10-3)为界值，外周血LINC00342相对表达水平≥3.07×10-3为高表达组(n=45)，<3.07×10-3为低表达组(n=45)。结果显示，LINC00342低表达组患者的2hPBG水平高于LINC00342高表达组(P<0.05)，而两组的血压、空腹血糖、血脂水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 不同外周血LINC00342相对表达水平的急性缺血性脑卒中患者的血压、血糖和血脂水平的比较

组别n总胆固醇[M(P25,P75),mmol/L]三酰甘油[M(P25,P75),mmol/L]HDL[M(P25,P75),mmol/L]LDL[M(P25,P75),mmol/L]VLDL[M(P25,P75),mmol/L]LINC00342高表达组455.25(4.35,5.89)1.65(1.21,2.56)1.12(0.94,1.25)3.28(2.56,3.89)0.77(0.55,1.03)LINC00342低表达组454.89(4.24,5.58)1.30(1.04,1.88)1.10(0.94,1.38)2.96(2.49,3.57)0.60(0.47,0.85) t/W值988.0751 046.501808.541988.5211 078.053P值0.2450.0860.6420.3330.077

3 讨 论

近年来，有研究表明lncRNA可通过调节细胞存活、炎症反应和血管生成在缺血性脑卒中的发生和发展中发挥重要作用，如ANRIL、MALAT1、N1LR、MEG3、H19、C2dat1、FosDT、SNHG14、TUG1[8]。相对于健康对照组，缺血性脑卒中患者的外周血白细胞的ZFAS1表达水平显著降低[9]，而外周血白细胞的lncRNA-MIAT[10]、血浆淋巴细胞和中性粒细胞的lncRNA-H19表达水平显著升高[11]。Shen等[12]通过挖掘GSE48060数据库构建lncRNA共表达网络，发现LINC00342在急性心肌梗死疾病的发病中起到重要作用。但目前未见有关LINC00342与脑卒中之间的关系的研究。而急性心肌梗死是心肌在冠状动脉粥样硬化病变的基础上发生缺血缺氧而坏死的疾病[13]，与缺血性脑卒中的病理形成过程(即动脉粥样硬化基础上发生局部脑缺血坏死)相似。因此，我们推测LINC00342与急性缺血性脑卒中的发病存在一定的关联。本研究结果显示，急性缺血性脑卒中患者外周血的LINC00342相对表达水平低于健康者(P<0.05)。由此可见，LINC00342也可能参与了急性缺血性脑卒中的发生过程。脑部缺血后，缺血中心区和在缺血中心区与正常组织之间的缺血半暗带成为主要的受损组织，而细胞凋亡是缺血半暗带细胞死亡的主要形式，可在脑部缺血后数小时后发生[14]。LINC00342已被报告与癌症细胞的凋亡相关。例如，Miao等[15]发现LINC00342在结肠腺癌组织中过表达，而在结肠腺癌细胞系中敲低LINC00342，可抑制细胞增殖和迁移，并促进细胞凋亡。因此，LINC00342可能通过影响细胞增殖、凋亡，从而参与缺血性脑卒中的发生、发展，但具体机制需要进一步探索。

血糖水平与缺血性脑卒中的发生有关，高血糖是缺血性脑卒中发生的危险因素之一[16-17]，高血糖通过酸中毒、活性氧/活性氮、炎症和线粒体功能障碍4个途径，增加脑卒中的发生风险。已有研究表明，lncRNA在一些疾病中调节了葡萄糖代谢。例如，lncRNA-UCA1通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白-信号转导和转录激活因子3/miR-143-己糖激酶2通路促进癌细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成[18]。在胶质瘤中，lncRNA-XIST作为与miR-126竞争的内源性RNA在胶质母细胞瘤细胞中调控胰岛素受体底物1/ 磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路，介导细胞增殖和葡萄糖代谢[19]。本研究结果显示，在急性缺血性脑卒中患者中，低表达组患者的2hPBG水平高于高表达组患者(P<0.05)，提示LINC00342的相对表达水平可能影响急性缺血性脑卒中患者的血糖代谢，这又可能进一步使患者病情恶化。

总之，急性缺血性脑卒中患者的外周血LINC00342相对表达水平下调，外周血LINC00342的相对表达水平可能影响急性缺血性脑卒中的发生和患者机体的血糖代谢。今后，有必要进一步探索LINC00342影响缺血性脑卒中发生、发展的生物学功能和分子机制，为该病的诊治提供新的靶点。