基于HPLC-Q-TOF-MS/MS技术的藏药熏倒牛化学成分分析

李 运 李燕君 张国强 李红玉 景 明*

1.兰州市食品药品检验检测研究院/甘肃省种植中药材外源性污染物监测工程研究中心，甘肃 兰州 730000；2.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000

熏倒牛为民间常用藏药，来源于牻牛儿苗科熏倒牛属植物BiebersteiniaheterostemonMaxim的干燥全草，由于其花蕊色黑如紫菀，青海藏医将其作为明见赛保的代用品[1]，主要分布于甘肃、宁夏六盘山西坡和中卫、青海东部和南部、四川西北部(若尔盖)等地[2]，资源丰富，具有散肿止痛、治热性炭疽、疔疮痈疔的功效[1]。据调研，民间可用于抑菌、鼻窦炎、脑膜炎及过敏性疾病等的治疗，通常将新鲜的药材切段后，捣碎、煎煮、去渣、熬至稠膏状，与其他药物配伍使用。现代研究[3-5]表明，熏倒牛主要含有生物碱类、黄酮及其苷类、苯丙素类、脂肪酸类等化合物，具有抑菌[6]、抗炎镇痛[7]、降血糖[8]等药理活性。

本课题组前期研究发现熏倒牛药材提取物毒性研究表明，其口服安全可靠[9]；同时，利用药理效应法对其不同提取工艺进行评价，发现熏倒牛70%乙醇提取物的抗炎、镇痛作用显著[10]。然而，目前关于熏倒牛药材的质量控制研究相对较少，仅见其性状、显微鉴别与木犀草素[11]、山羊豆碱[12]的含量测定研究，较系统的对其所含主要化学成分进行分析鉴定的相关研究尚未见报道。借助于高分辨质谱技术，利用其具有灵敏度高，可提供精确质量数的强大定性能力，根据高分辨质谱提供的化合物精确分子质量、碎片离子信息及对照品信息，并结合相关文献数据，对熏倒牛中的主要物质基础进行定性分析，从中初步鉴定出 25个化学成分，主要为脂环族有机酸类、香豆素类、多酚类、蒽醌类及黄酮醇类化合物，并首次鉴定出了熏倒牛中的14个黄酮类成分，为研究熏倒牛药材的药效物质基础及质量标准提升研究提供了实验依据。因此，建立一种灵敏、可靠、快速的方法系统分析和鉴定熏倒牛中的化学成分，对该药材的质量控制和物质基础研究具有重要意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1290-6545高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪(Agilent Technologies，美国)； MS105DU电子天平(Mettler Toledo,瑞士)，SBL-10DT超声波恒温清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司，中国)。

1.2 材料 对照品儿茶素(批号：110877-201604)、橙皮苷(批号：110721-202019)、芦丁(批号：100080-201811)、槲皮素(批号：100081-201610)、杨梅苷(批号：111860-201703)、芹菜素(批号：111901-201603)均购自中国食品药品检定研究院；伞形花内酯(批号：RFS-S02511812016)、异槲皮苷(批号： RFS-Y07601904023)、芹菜素(批号： RFS-Q00211801030)、木犀草素(批号： RFS-M00701904022)均购自成都瑞芬思生物技术有限公司；乙腈为色谱级，水为Milli-Q超纯水，其他试剂均为分析纯。

实验所用样品信息详见表1，采集于2019年8月至2020年10月，并经甘肃中医药大学定西校区张尚智教授鉴定为牻牛儿苗科熏倒牛属植物BiebersteiniaheterostemonMaxim的干燥全草。

表1 样品来源

2 方法

2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取各对照品适量，加50%甲醇使其溶解，制成各成分质量浓度处于 10～20 mg·L-1的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取熏倒牛药材粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25 mL，称定重量，超声提取(频率 40 kHz，功率 300 W)1 h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，经 0.22 μm 微孔滤膜滤过，备用。

2.3 色谱条件 采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(3.0 mm×150 mm，1.8 μm)； 0.1%甲酸的乙腈(A)和含0.1%甲酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～35 min，5%-40%A；35-55 min，40%-95%A；55～60 min，95%-5%A；60～65 min，5%A)，流速：0.250 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样体积：2 μL。

2.4 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)，负离子模式检测；碰撞气为氮气；干燥气流速为 12.0 L·min-1；鞘气流量为10.0 L·min-1；雾化气压力为 40 psi；毛细管电压为3500 V；碰撞电压为135 V；扫描范围为50～1500 m/z；母离子的 MS/MS 碰撞能为 10～50 eV。

2.5 数据采集与处理 数据工作站为 MassHunter Version B.06.01软件，通过对所有样品的离子流图进行比较，遴选代表性药材进行质谱解析。

2.6 化学成分鉴定 查阅藏药熏倒牛相关化学成分研究文献，并收集化学成分信息，应用MassHunter Version B.06.01、PCDL Manager B.07.00软件，根据测得的精确相对分子质量，在规定的误差范围内(±5.0 ppm)计算可能的元素组成，并通过分析各物质的保留时间、分子离子峰、二级特征碎片离子等信息，结合对照品确认和文献数据信息，对化合物进行分析鉴定。

3 结果

3.1 不同产地熏倒牛的总离子流图比较 对不同产地熏倒牛总离子流图进行分析，如图1所示，结果提示各产地样品的 TIC图基本相似，但各峰相应的离子强度有一定差异，说明不同产地熏倒牛中的化学成分种类基本一致，但含量存在差异。其中，甘肃省合作市卡加曼乡样品(样品编号：BH-01)中各离子强度相对较高，故以该样品为典型样品，对熏倒牛的化学成分进行鉴定。

3.2 熏倒牛典型样品中化学成分的鉴定 采用HPLC-Q-TOF-MS/MS对样品1的50%甲醇提取物中的化学成分进行分析，如图2所示。结果发现黄酮类、有机酸及酚酸类成分在负离子模式下有较高的响应；从该样品50%甲醇提取物中共鉴定出25个成分，包括 1个脂环族有机酸类、2个香豆素类、2个多酚类、1个蒽醌类及19个黄酮类化合物。相关质谱信息见表2。

3.3 主要化合物质谱裂解规律及结构鉴定 以峰 2 为例，其准分子离子峰为m/z 787.2450 [M-H]-，推测分子式为 C33H40O22。该离子分别失去一分子葡萄糖残基(C6H10O5)和一分子龙胆双糖残基C12H20O10产生碎片离子m/z 625.1861[M-H-162Da]-和m/z 463.1205[M-H-324Da]-。碎片离子 m/z 463.1205分别失去一分子H和一分子葡萄糖残基C6H10O5产生碎片离子m/z 462.1181和m/z 300.0571。碎片离子 m/z 300.0571继续失去一分子H得到碎片离子m/z 299.0498。因此，推断该化合物为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-O-β-D-龙胆双糖苷，其二级质谱图和可能的裂解规律如图3所示。

以峰14为例，其准分子离子峰为m/z 463.1244 [M-H]-，推测分子式为 C21H20O12。该离子分别失去一分子葡萄糖残基(C6H10O5)产生碎片离子m/z 301.0642[M-H-162Da]-，继而分别失去一分子中性离子CH2O和一分子中性离子C8H6O3得到碎片离子m/z 271.0552 [M-H-162Da-30Da]-和151.0045 [M-H-162Da-150Da]-。因此，推断该化合物为异槲皮素，它的二级质谱图和可能的裂解规律如图4所示。

以峰21 为例，其准分子离子峰为m/z 285.0682 [M-H]-，推测分子式为 C15H10O6。该离子分别失去一分子离子C6H6O2，C8H6O2和C7H4O4产生碎片离子m/z 175.0616[M-H-110Da]-，m/z 151.0232[M-H-134Da]-和m/z 133.0477[M-H-152Da]-。碎片离子m/z 151.0232继而失去一分子CO2得到碎片离子m/z 107.0301。因此，推断该化合物为木犀草素，其二级质谱图和可能的裂解规律如图5所示。

以峰23为例，其准分子离子峰为m/z 269.0732[M-H]-，推测分子式为 C15H10O5。该离子分别失去一分子离子CO2，C8H6O和C7H4O4产生碎片离子m/z 225.0803[M-H-44Da]-，m/z 151.0230 [M-H-118Da]-和m/z 117.0515[M-H-152Da]-。碎片离子m/z 225.0803和m/z 151.0232继而分别失去一分子C2H2O2和CO2得到碎片离子m/z 183.0669和107.0293。因此，推断该化合物为芹菜素，其二级质谱图和可能的裂解规律如图6所示。

4 讨论

预试验对熏倒牛50%甲醇提取物分别进行了正、负离子质谱扫描模式考察，总离子流图提示，熏倒牛药材50%甲醇提取物的物质组成在负离子扫描模式下具有较好的响应值，信息丰富；而在正离子扫描模式下响应值较低，且化合物数量较单一。故本文选用负离子模式进行数据的采集与分析。

本研究基于HPLC-Q-TOF-MS/MS 技术，建立了熏倒牛属植物熏倒牛50%甲醇提取物中主要化合物的快速鉴别方法。对采集于不同产地、不同海拔的 4批熏倒牛药材进行分析，发现其化学成分组成基本一致，故从中选择1批次典型样品进行分析鉴定。通过检索、归纳已报到的熏倒牛属及其近缘属植物化学成分信息、结合SciFinder 和ChemSpider 等在线质谱库资源以及标准物质的质谱数据，建立熏倒牛属植物物质数据库，并对熏倒牛提取物中的25个化合物进行了准确归属。初步鉴定结果提示，熏倒牛 50%甲醇提取物主要含有黄酮类化合物(tR在11～37 min)，如槲皮素、山奈酚、芹菜素、木犀草素及以其为苷元的多种黄酮苷类成分，此类物质在抗氧化、抗菌、抗炎及抗肿瘤等方面具有良好的药理活性。另在tR为42～60 min内的部分化合物尚未能准确归属，有待进一步的深入研究。

通过本研究，建立了一种快速、灵敏、重复性好的方法对熏倒牛中主要化学成分进行较系统的定性分析，初步揭示了其主要物质基础，丰富了该药材的成分信息，为进一步挖掘潜在药用价值、阐释药效机理及深入开发、综合利用该资源奠定了基础。