复方板蓝根颗粒HPLC指纹图谱研究

陈 丹 戚建中 符国成 陈海刚 杨一栋 李 柯

1.湘潭医卫职业技术学院，湖南 湘潭 411102；2.华润三九(郴州)制药有限公司，湖南 郴州 423000；3.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410013

复方板蓝根颗粒由板蓝根600 g、大青叶900 g组成，具有清热解毒、凉血的功效，临床用于温病发热、出斑、风热感冒、咽喉肿烂、流行性乙型脑炎、肝炎、腮腺炎，使用广泛，疗效明确。经国家食品药品监督管理局网站查证，全国共有150家生产企业。复方板蓝根颗粒质量标准收载于卫生部药品标准中药成方制剂第十二册(标准号：WS3-B-2377-97[1])。依据2011年《已上市中药变更研究技术指导原则(一)》、2017年《已上市中药生产工艺变更研究技术指导原则》、2019年《已上市中药药学变更研究技术指导原则》(征求意见稿)等技术指导原则，本品变更了药品处方中已有药用要求的辅料，改变了影响药品质量的生产工艺，为更系统、全面地评价工艺变更后产品的质量，研究建立了本品指纹图谱检测方法[2-3]，采用2012年版中药色谱指纹图谱相似度评价系统对10批成品进行相似度评价，所建立的方法稳定、可靠、重复性好，能够更好地控制复方板蓝根颗粒的质量。

1 材料

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；梅特勒-托利多XS204电子分析天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)；KQ5200DA 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 鸟苷对照品(111977-201501，含量93.6%)，尿苷对照品(110887-201803，含量99.5%)，腺苷对照品(110879-200202，含量100%)，R,S-告依春对照品(111753-201706，含量100%)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，色谱级]；其他试剂均为分析级。

1.3 样品 复方板蓝根颗粒[批号：1908001、1908002、1908003、1908004、1908005、1908006、1908007、1908008、1908009、19080010，华润三九(郴州)制药有限公司]。

2 方法与结果[4-8]

2.1 色谱条件 Kromasil 100-5-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱(0～2 min，3%A；2～20 min，3%→6% A；20～25 min，6%→9% A；25～33 min，9% A；33～40 min，9%→20% A；40～50 min，20% A；50～85 min，20%→60% A；85～90 min，60%→3% A；90～95 min，3% A)；检测波长为254 nm，流速为0.8 mL·min-1；柱温为25 ℃，进样体积10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取尿苷对照品、鸟苷对照品、(R，S) -告依春对照品和腺苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇分别制成每1mL 含尿苷20 μg、鸟苷20 μg、(R，S)-告依春20 μg和腺苷25 μg 的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加5%甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声处理( 功率500 W，频率40 kHz) 5 min使溶解，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适应性试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，按照“2.1”色谱条件操作，记录色谱图。如图1所示。

2.3.2 精密度考察 取复方板蓝根颗粒(批号1908001)，按确定的方法制备供试品溶液，连续进样6次，指纹图谱方法的精密度结果相似度>0.9，色谱峰相对保留时间及相对峰面积RSD<3%。结果表明，仪器精密度良好。

2.3.3 重复性考察 取复方板蓝根颗粒(批号1908001)，按确定的方法平行制备6份供试品溶液，测定指纹图谱，指纹图谱的重复性结果相似度>0.9，色谱峰相对保留时间及相对峰面积RSD<3%。结果表明：方法重复性良好。

2.3.4 稳定性考察 取复方板蓝根颗粒(批号1908001)，按确定的方法制备供试品溶液，分别在约0、3、6、9、12、21、27、30、38、46、50、56 h进样，指纹图谱方法的精密度结果相似度>0.9，色谱峰相对保留时间及相对峰面积RSD<3%。结果表明：供试品溶液在56h内测定稳定。

2.4 HPLC指纹图谱的建立与共有峰的标定

2.4.1 指纹图谱的建立 取各批复方板蓝根颗粒，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定，进样10 μL，得到10批复方板蓝根颗粒HPLC指纹图谱，基于直观法和指纹特征图谱选择要求(若峰数多于10个，且最大峰面积超过总峰面积的70%，或峰数多于20个，且最大峰面积超过总峰面积的60%，应考虑去除该色谱峰)，拟定本品指纹图谱特征峰个数为10个。并以分离效果好且具代表性的尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春、腺苷作为参照峰。如图2、图3所示。

2.4.2 共有指纹峰的标定 复方板蓝根颗粒HPLC指纹图谱中，共有色谱峰10个，以4号峰(R，S) -告依春为参照峰(S)，计算各色谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱中S峰的保留时间和保留峰面积比值。见表1、表2。

表1 10批复方板蓝根颗粒指纹图谱共有峰的相对保留时间

表2 10批复方板蓝根颗粒指纹图谱共有峰的相对峰面积

2.5 相似度评价 取复方板蓝根颗粒样品，共计10批，按照拟定供试品溶液制备方法制备，色谱条件测定，记录色谱图，色谱图扣除0～3.0 min(溶剂峰)，采用2012年版中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以R色谱图为参照图谱，时间窗宽度设定0.1 min，用平均数法生成各自对照指纹图谱图，同时计算相似度。色谱峰见图4，计算结果见表3，结果表明：大生产样品相似度均在0.95以上，说明按现有工艺能试制，批间差异小，样品质量稳定。

3 讨论

3.1 参照峰的选择 参照文献[9]分别收集处方中各药味对应的指标成分对照品，配制相应的对照品溶液，照指纹图谱检测方法检测，在UV图谱中无靛蓝和靛玉红的对应的色谱峰，且该两成分的色谱峰叠加在一起。氨基酸类成分(精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸)无紫外吸收，而尿苷、鸟苷、腺苷、(R，S)-告依春均能良好的分离，且保留时间及峰面积大小适中，前后无干扰峰，因此确定尿苷、鸟苷、腺苷、(R，S)-告依春作为指纹图谱参照物。

3.2 不同品牌色谱柱考察 分别考察Waters-Xselect-C18、Kromasil 100-5-C18和Agilent ZOR BAX-C18三种色谱柱对指纹图谱的影响。该色谱条件下，Agilent ZOR BAX-C18色谱柱供试品中各色谱峰成分分离效果明显较差，Waters-Xselect-C18、Kromasil 100-5-C18均能较好的分离各个色谱峰，但Waters-Xselect-C18总峰数少于Kromasil 100-5-C18，故本试验采用Kromasil 100-5-C18色谱柱，同时建议后续实验使用同款色谱柱。

3.3 柱温的考察 按拟定的方法对不同柱温(20 ℃、25 ℃、30 ℃)进行考察，结果柱温的变化会对四个成分的保留时间造成影响，25 ℃时指纹图谱整体分离效果最好，因此明确本方法柱温为25 ℃。

3.4 不同流速的考察 按照初步确定的色谱条件，微调流速，考察不同流速(0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min)。结果不同流速对色谱峰的保留时间有所影响，流速0.8 mL/min指纹图谱整体分离效果最好，因此流速定为0.8 mL/min。

4 结论

本研究建立了复方板蓝根颗粒的HPLC指纹图谱方法，方法学考察，色谱峰相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3%。采用建立的指纹图谱检测方法对10批复方板蓝根颗粒进行测定，大生产样品相似度均在0.95以上，表明采用指纹图谱对样品质量进行控制，方法简便、稳定、专属性强、重复性好，能辅助含量测定方法全方位地保证药品质量的稳定均一，对复方板蓝根颗粒临床安全合理用药具有重要意义。