巴豆霜对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马区ERK5通路的影响

马玉玮 潘佐泱 丁义东 张雪杰 戴炎荣 岳 云 何生存 贾孟辉

1.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学第二附属医院，宁夏 银川 750001；3.宁夏中卫市海原县中医医院，宁夏 海原 751800；4.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川 750004

急性缺血性脑卒中是各种原因导致的脑组织血液供应障碍，并由此产生缺血缺氧性坏死，进而出现神经功能障碍的一组临床综合征[1]。本病是常见的卒中类型，约占全部卒中的60%～80%。其年发病率为109.7/10万～217/10万，致残率高达75%，死亡率为116/10万～141.8/10[2]。在我国致残病因中位居榜首，且男性发病率高于女性，给患者的家庭带来了巨大的经济压力。然而该疾病的病因和发病机制较为复杂，现代医学对其针对性的治疗手段有所欠缺。因此，积极寻求防治缺血性脑卒中的有效疗法和药物，无疑具有深远的社会意义。

目前，现代医学对缺血性脑血管病的治疗，主要包括内服药物和外科手术治疗，如扩容、抗凝、血液稀释、血管介入等系列疗法，其中改善脑局部血液循环和神经保护是近年来的研究热点[3]。尽管这些方法在临床中取得了一定的成效，但由于自身所存在的局限性，疗效终究未能令人满意，如治疗周期长、出血风险高、副作用多、治疗花费大等。因此积极寻求一种低廉、有效、安全、副作用少的治疗方法，已成为当今社会亟需解决的重点问题。有研究[4-5]表明，失苔刺知丸及各拆方巴豆霜组均可改善大鼠脑缺血再灌注后的神经功能损伤，这可能与其参与调节MAPK-ERK通路中ERK5 的表达相关。本研究通过对ERK5的检测，探讨巴豆霜的相关的神经保护策略。

巴豆为大戟科植物巴豆的干燥成熟果实，其味辛、性热，有大毒，外用治疗恶疮疥癣、疣痣[6]。其主要含有脂肪油( 40%～60% )、生物碱、蛋白质(约18% )、萜类等成分[7]。现代研究[8]表明，巴豆油具有强烈刺激性，吸收后能与肠液作用生成巴豆酸，引起剧烈的泻下作用;查阅历代文献可以发现，自汉代《神农本草经》收录以来，已经创造和总结了诸多合理巴豆炮制方法和经验，如:制霜、熬、煨、炮等方法去毒，应用麦麸、大麦、面、米等辅料减毒增效，而现代巴豆的炮制主要是取仁生用和制霜2种[9]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 本实验SD大鼠的使用按宁夏医科大学动物伦理委员会批准的程序进行, 选取体重220～250 g的大鼠饲养在装有空调房间的聚丙烯笼中，保持温度在(22±0.5)℃，光/暗周期12 h/12 h,并用标准实验室饲料和水随时饲养。

1.1.2 药品与主要试剂 巴豆霜由宁夏银川市第一人民医院药剂科提供;实验中所用西药尼莫地平片(nimodipine tablets)规格为：30 mg×20片，国药准字H20003010。水合氯醛(分析纯)、无水乙醇(分析纯，北京化学试剂公司)、二甲苯、苏木精水溶液、伊红染色液、0.9%氯化钠注射液、蒸馏水、磷酸盐缓冲液(PBS)溶液等由宁夏医科大学实验室提供;ERK5 抗体、Phospho- ERK5 antibody (Affinity，AF3318)、山羊抗兔(bioeasy,BE0101)、Actin(easybio,BEO021)。

1.1.3 仪器 电子天平(Sartorius公司，德国)、移液枪(Eppendorf公司，法国)、-80℃低温冰箱(青岛海尔)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Milipore，美国)、医用X射线胶片(柯达公司，美国)、组织切片机(RM 2235，德国LEICA公司)、高速离心机(Eppendorf公司，德国)、转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司)，电泳仪(北京六一仪器厂)、凝胶玻璃板、固定夹、垂直电泳槽、转移槽(北京六一仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及用药 分组：将192只SD雄性大鼠进行随机分组，平均每组12只，共16组，分别为：假手术组(A组)12只，巴豆霜高剂量组(B组)12只，巴豆霜中剂量组(C组)12只，巴豆霜低剂量组(D组)，尼莫地平组(E组)各12只，模型组(F组)12只，而后5组实验组又依据取样时间点的不同分为1 d、3 d、7 d组。用药：所有雄性SD大鼠统一时间点灌胃，2次/d(早晚各1次)。假手术组(A组)不分时间，总共灌胃7 d，而后5组依照1 d、3 d、7 d 3个时间点进行灌胃。其中假手术组(A组)和模型组(F组)称重后给予生理盐水灌胃1 mL/100 g；巴豆霜高剂量组(B组)、巴豆霜中剂量组(C组)、巴豆霜低剂量组(D组)、尼莫地平组(E组)各组依各组用药进行灌胃，灌胃剂量为1 mL/100 g，具体灌胃剂量则根据SD雄性大鼠每日称重而定。

1.2.2 大鼠脑缺血再灌注模型制备 以改良的Longa法[10]行大鼠大脑中动脉阻断(middle cerebral artery occlusion，MCAO)后缺血再灌注损伤模型的制备。

1.2.3 模型纳入标准 用MCAO 模型SD大鼠缺血2 h后进行再灌注，根据大鼠神经功能表现分别对应下表中的评分项标准，而1分、2分、3分的视为模型成功，将其纳入实验，其余则为模型失败，将其剔除。

1.2.4 神经功能缺损评分 SD大鼠进行取材之前，根据Garcia JH[11]神经功能评分表进行相应评分，每组SD大鼠的评分为六项测试的加和。除假手术组外，大鼠神经功能评分加和超过15分的予以剔除。而其他组神经功能评分控制在3～18分之间，评分越高，神经功能恢复程度越好，反之则越差。

1.2.5 取材及标本制备 取材分别于术后1 d、3 d、7 d进行。10%水合氯醛按0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，随机选取每组大鼠中的12只，麻醉后迅速打开已放置在冰袋上的大鼠的胸腔，使其心脏充分暴露，找准心尖，插管并快速用0.9%生理盐水冲洗灌注，当看到流出液颜色变清澈，肝脏血色退去，换4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌流固定，至肝脏变硬时，大脑内固定成功，迅速断头取出新鲜全脑组织，固定在4%多聚甲醛固定液中，然后做脑部冠状切片，用于HE染色、免疫荧光检测。每组其余大鼠于各时间点麻醉后处死，于冰上快速断头取出新鲜脑组织并迅速剥离海马组织，剥出的海马组织立即装入冻存管放置于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot和PCR的检测。

2 实验结果

2.1 各组SD大鼠Garcia JH评分比较 本研究采用Garcia JH评分量表对大鼠神经功能进行评估。结果显示，与假手术组相比，模型组和各药物治疗组的神经功能评分明显降低，最小值出现在I/R模型组。随着巴豆霜浓度的增加，神经功能评分逐渐升高。尼莫地平组得分略高于巴豆霜低剂量组，低于巴豆霜中剂量组和高剂量组。除假手术组外，所有组的神经功能评分均随时间的延长而增加(表1)。

表1 各组SD大鼠 Garcia JH 评分比较

2.2 HE染色法观察各组大鼠脑组织缺血侧病理形态学改变 经HE染色，观察各组大鼠神经元的形态结构。结果表明,与假手术组(A组)相比，模型组神经元(F组)松散排列、无序、模糊,细胞核和细胞质之间的界限不清楚。给予巴豆霜后，神经细胞损伤大大缓解,坏死和凋亡细胞的数量减少,特别是高剂量巴豆霜组(SCP)。尼莫地平组与模型组相比，尼莫地平也能明显改善大鼠的组织损伤情况。并且，经高、中剂量组的巴豆霜治疗后，神经细胞损伤逐渐减轻或维持稳定。如图1所示。

2.3 蛋白质印迹法测脑缺血再灌注大鼠脑组织海马区ERK5表达结果 结果显示，这些蛋白的磷酸化水平在造模后的大鼠缺血脑组织中与假手术组相比均上调；然而，使用巴豆霜和尼莫地平药物后，这些相关蛋白水平与假手术组相比明显降低。同时，在同一处理时间下，通路相关蛋白表达在不同浓度SCP组之间也有明显差异，随着SCP浓度度的增加，ERK5、p-ERK5表达水平逐渐下调，并逐渐接近假手术组；尼莫地平组与巴豆霜的低剂量组之间的蛋白表达在1 d和3 d有明显差异，但在7 d无差异；尼莫地平与巴豆霜的高、中剂量组之间均有差异。在同一组内，ERK5和p-ERK5的浓度随着时间的推移呈上调趋势。如图2所示和见表2。

表2 WB检测各组大鼠海马区p-ERK5/ERK5表达量

2.4 脑缺血再灌注大鼠脑组织海马区ERK5 的mRNA相对量结果 经PCR检测MAPK信号通路相关蛋白的mRNA，包括ERK5和p-ERK5的mRNA水平。结果显示，这些蛋白的mRNA表达水平在造模后的大鼠缺血脑组织中与假手术组相比均上调(如图3、4所示)；然而，使用巴豆霜和尼莫地平药物后，这些相关蛋白的mRNA表达水平与假手术组相比明显降低。同时，在同一处理时间下，通路相关蛋白的mRNA相对表达量在巴豆霜不同浓度组之间也有明显差异，随着巴豆霜浓度度的增加，ERK5的mRNA表达水平逐渐下调，并逐渐接近假手术组；尼莫地平组与巴豆霜低剂量组之间的蛋白表达在1 d和3 d有明显差异，但在7 d无差异；尼莫地平与巴豆霜的高、中剂量组之间均有差异。在同一组内，ERK5 mRNA随着时间的推移呈上调趋势。见表3。

表3 PCR检测各组大鼠海马区ERK5相对含量

3 讨论

巴豆治疗脑病历史悠久，源远流长，早在东汉时期，就有巴豆霜治疗脑病的记载。《本草》云：“巴豆，破症瘕、结聚、坚积、留饮、痰癖。”[12]宋代唐慎微《证类本草》云：“治中风，巴豆七枚，去皮研烂。涂两手心，以暖水一盏，安向手心，须臾即便正，洗去药，并频抽掣中指。”[13]清代汪昂《本草备要》曰：“巴豆油作纸拈燃火后吹息，或熏鼻，或刺喉，能行恶涎恶血，治中风中恶……一切急病。”[14]由此可以发现，历代医家在治疗脑卒中方面，擅用巴豆霜，并取得了良好的疗效。而对宁夏少数民族医药的文献检索发现，凡是治疗脑病的方剂中都含有巴豆霜，经统计，宁夏少数民族经典方[15]中“众风门”“杂证门”现存460首方剂中，含巴豆霜的方剂就有73首，占比15.87%，所载“巴豆丸”“失荅剌知丸”“扎里奴思方”“又扎里奴思方”等可用于治疗脑卒中口眼歪斜、半身不遂。目前，导师及其团队对“失荅剌知丸”在脑系疾病的临床防治和实验研究方面取得了一定的成果，失荅剌知丸有着消痰利水、化积散结、芳香开窍、启闭通络的功效。在临床方面，失荅剌知丸可以改善缺血性中风恢复期患者神经功能缺损症状，如失眠、便秘、痴呆、吞咽功能障碍等[16-20]。对腔隙性脑梗死患者认知功能障碍发挥有效作用[21]，并且在对椎-基底动脉供血不足的治疗中效果显著[22]。在实验方面，探讨了失荅剌知丸对大鼠脑缺血再灌注后的神经功能损伤、神经细胞凋亡，均具有改善作用，这可能与其参与调节 MAPK-ERK通路中ERK1/2及ERK5的表达相关[23-25]。

为了进一步证实巴豆霜在防治脑病发挥的作用，笔者将失荅剌知丸进行了拆方研究，其中拆方研究发现以巴豆霜加三药(柴胡、黑诃子、芦荟)组疗效最好，因此考虑该组药可能是失荅剌知丸中能有效改善脑缺血再灌注损伤的主要药物组成，在对比各拆方组的方药发现，各拆方组中均含有巴豆霜，且巴豆霜单味药能够减轻大鼠脑缺血再灌注后的神经功能的损伤程度。因此，笔者提出如下假说，巴豆霜可能是失荅剌知丸的君药，并且巴豆霜可能在脑保护机制中发挥着重要作用。为进一步证实失荅剌知丸发挥脑保护作用的是巴豆霜，笔者在拆方研究的基础上将巴豆霜单味药拿出研究，研究的目的就是找到巴豆霜在改善脑缺血再灌注损伤方面是否具有明显效果，为进一步简化方药组成以及进一步提纯药物的有效成份，改变中药制剂剂型做准备。

ERK是MAPK家族中重要的成员之一，它正常状态下处在静止的胞质里，但激活后移动至胞核，从而发挥其作用。当大脑发生缺血或缺氧后，广泛存在于中枢神经系统中的ERK蛋白，在神经元中被激活进而参与细胞的各种应急反应，调节细胞的凋亡、增殖和分化等一系列生理活动。MAPK信号通路被细胞外应激激活物激活后，其发挥作用遵循MAPKs的三级酶促级联反应，Ras/Raf/ERK级联是调控细胞增殖、细胞周期和凋亡的重要通路[26]。简而言之，Ras引导并激活蛋白激酶Raf，而后者可以通过促进ERK的磷酸化程度调控机体的生物化学反应[27]。

ERK5是1995年被Zhou等[28]和Lee等[29]首次克隆并测定的，其位于细胞质和细胞核中，分子量为115000，因其分子量较大，故也称大MAPK通路[30]。当MAPK信号通路被细胞外应激激活物激活后，MAPK以三级激酶级联酶促反应的方式将信号转导至家族其他信号通路，ERK5作为MAPK中独特的激酶，ERK5的活化形式为pERK5，活化后的ERK5进入细胞核通过磷酸化发挥抗凋亡的作用[31]。同时也对细胞的生存、增殖、分化等有重要的调节作用。脑缺血再灌注损伤发生后，毛成远等[32]使用三七皂苷Rg1对血管性痴呆大鼠模型进行干预，发现三七皂苷Rg1能抑制海马神经元凋亡，改善海马组织炎症和氧化损伤，从而提高VD大鼠认知功能，其机制可能与MEK5/ERK5信号通路激活有关。聂葵葵等[33]持续观察了大鼠脑缺血与脑出血转变时其脑组织ERK5的活化表达程度，结果证实：大鼠脑缺血与脑出血的转化能够诱发相应蛋白的磷酸化表达，进而在脑缺血及出血转变历程中发挥积极作用，从而进一步证实了ERK5对神经细胞的保护作用。

本实验结果表明，通过HE的检测，发现巴豆霜能够修复缺血性脑卒中神经细胞的形态结构，改善脑缺血损伤引起的神经功能缺损。这提示，巴豆霜对再灌注损伤大鼠的脑缺血损伤有明显的神经保护作用，这种神经保护作用可能与实验性缺血后大鼠认知功能的改善有关[34]。通过免疫印迹和PCR结果分析显示，模型组和各药物干预组中ERK5蛋白的磷酸化表达和mRNA的增殖在1～3 d内上升较为明显，而在3～7 d内逐渐趋于平稳，这说明细胞的增殖和修复是有阈值的，如果达到阈值后，细胞将进入相对缓慢的修复和增殖过程。但是经药物组治疗后发现，p-ERK5的水平呈下降趋势，且随时间的推移，逐渐接近假手术组的表达水平；其中巴豆霜高剂量组表达水平下降最为明显。脑缺血后大鼠ERK5通路被激活，参与损伤后神经元细胞的修复和增殖，从而发挥神经保护作用。基于这些发现,可以得出结论,巴豆霜可改善脑缺血再灌注中细胞的受损情况，增强细胞的增殖活动，从而发挥脑保护作用。