多糖作为兽用疫苗佐剂作用机制的研究进展

史 茜，徐新峰，李学文，肖媛媛，白梅花，张富春

(1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；2.乌鲁木齐海关技术中心，乌鲁木齐 830063)

多糖是由至少10个单糖分子脱水聚合而成的高分子碳水化合物，可形成直链或分支长链，结构复杂且庞大。多糖在自然界分布广泛，从天然产物中分离出的多糖化合物多达数千种，根据其来源不同可分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖。多糖具有免疫调节、抗病毒、抗炎、抗氧化等多种功能活性[1]。天然来源的多糖具有毒副作用小、安全性高、功能多样，并具有广谱免疫调节作用等优点，临床已有获得兽药证书的黄芪多糖和香菇多糖。

免疫佐剂是指一类能非特异性地增强或改变机体对匹配抗原的特异性免疫应答，增强抗原的免疫原性或改变免疫的反应类型，但其本身并无抗原性的一类物质[2]。常用兽用疫苗免疫佐剂按其成分及来源可分为油乳佐剂、无机佐剂、人工合成佐剂、生物性佐剂等。多糖促进免疫调节具有多靶点、多功能和多因子效应[3]，因此可广泛用作兽用疫苗免疫佐剂。 笔者阐述了多糖作为免疫佐剂对免疫器官、免疫细胞、免疫分子作用的相关机制及多糖受体关系等内容。

1 多糖对免疫器官的促进作用

免疫器官分为中枢免疫器官和外周免疫器官。中枢免疫器官包括胸腺和骨髓及鸟类法氏囊，主要是免疫细胞发生、分化和成熟的场所，如法氏囊是B细胞诱导和分化的场所，胸腺则为T细胞诱导和分化的场所；外周免疫器官包括淋巴结、脾脏、黏膜相关淋巴组织，主要是成熟T细胞和B细胞定居的场所，也是免疫细胞在抗原刺激下发生免疫应答的部位。多糖通过刺激免疫器官自身的细胞生长发育和分裂增殖，导致免疫器官重量或指数的增加，从而达到增强免疫反应的作用[4]。金丝小枣多糖(Ziziphusjujubapolysaccharide,ZJP)可显著提高环磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)导致的免疫抑制蛋雏鸡胸腺和法氏囊指数，可显著缓解环磷酰胺导致的脏器萎缩[5]。脾脏是动物最大的外周淋巴器官，富含多种免疫细胞，脾脏增殖代表着动物免疫系统的增强[6]。黄芪多糖(Astragaluspropinquuspolysaccharide,APS)能使小鼠、猪和海兰褐雏鸡的脾脏指数提高，同时提高胸腺及法氏囊等免疫器官的重量[7]，云芝中提取的蛋白结合多糖K作为卵清蛋白(oval bumin,OVA)p323-339疫苗佐剂可导致引流淋巴结肿大，淋巴结中细胞总数升高，CD11c+树突细胞(dendritic cell,DC)的百分比和数量显著增加，并上调CD80、CD86、主要组织相容性复合体Ⅱ类(MHCⅡ)和CD40的表达量，从而促进树突细胞的活性增加[8]。

2 多糖对免疫细胞的作用

多糖通过调节多种免疫细胞的活性发挥佐剂作用,其能通过增强巨噬细胞吞噬能力和自然杀伤细胞(NK细胞)的杀伤能力调节固有免疫反应；通过提高树突细胞的抗原递呈能力，从而诱导T淋巴细胞亚群(Th1、Th2、Th17、Treg和细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞))的分化并诱导B淋巴细胞产生特异性抗体，激活适应性免疫反应；通过刺激细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)、干扰素(interferon,IFN)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)等的产生发挥免疫调节作用(图1)。

图1 多糖对免疫细胞的作用机制Fig.1 Mechanism of polysaccharide on immune cells

2.1 增强巨噬细胞吞噬活性及抗原递呈能力

巨噬细胞作为固有免疫的组成部分，在应对病原体感染时起到吞噬作用，同时其也是一类抗原递呈细胞，参与机体的细胞免疫和体液免疫。 多糖作为疫苗佐剂，可改变巨噬细胞的体积，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进NO和细胞因子分泌，增强酶活性[9-11]。 以五味子多糖(Schisandrachinensispolysaccharide,SCP)为佐剂，联合毕赤酵母表达的鸭IgY Fc与鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)的融合蛋白OmpA-Fc进行免疫，对雏鸭的免疫应答具有明显的调节作用，能显著增强巨噬细胞的吞噬功能，提高血清抗体滴度、增加CD4+T细胞和CD8+T淋巴细胞数量、促进淋巴细胞转化率和血清IL-2和IL-4水平[12]。多糖佐剂也可增强巨噬细胞的抗原递呈能力，将仙茅多糖(Curculigoorchioidespolysaccharide)与流感疫苗同时注射免疫昆明小鼠，免疫3 d后提取各组小鼠腹腔巨噬细胞，经流式细胞仪检测显示，不同浓度的仙茅多糖均可促使腹腔巨噬细胞表面CD80、CD86和小鼠MHCⅡ出现不同程度的表达上调[13]。

2.2 增强NK细胞杀伤能力

NK细胞通过免疫调节作用，可增强宿主对病毒、细菌和某些寄生虫的抵抗力，并具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力[14]。多糖可通过调节NK细胞的细胞毒性、促进细胞因子及免疫调节介质的产生发挥佐剂功能。通过人参多糖(Panaxginsengpolysaccharide,GPS)对环磷酰胺免疫抑制的小鼠NK细胞毒性的研究发现，人参多糖能增加全血中NK细胞的数量，上调穿孔素和颗粒酶的表达，促进免疫抑制小鼠NK细胞的细胞毒性[15]。多糖可激活NK细胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-12和TNF-α等细胞因子，IFN-γ能增强NK细胞的活性，并促进原始Th细胞分化为Th1细胞。IL-12通过刺激NK细胞形成穿孔素，介导肿瘤和病毒感染细胞的凋亡[16]。使用黄芪多糖与鸡OVA经皮下免疫C57BL/6 小鼠，末次免疫7～14 d后，检测免疫小鼠血清和脾脏发现，黄芪多糖组小鼠OVA特异性抗体含量明显高于OVA组小鼠，但小鼠脾脏内NK和NKT细胞的百分比含量与OVA组和正常小鼠差别不大。经PI刺激后，黄芪多糖组小鼠脾脏内NK细胞中IL-4+细胞明显高于OVA组和正常组，且IFN-γ+细胞的比例明显下降；虽然经过PI刺激以后黄芪多糖组小鼠脾脏内NK细胞中IL-4+细胞升高不明显，但IFN-γ+细胞的比例明显下降[17]。

2.3 促进树突细胞的成熟和分化

树突细胞是一种抗原递呈细胞，能捕获、加工并递呈抗原给淋巴细胞以启动和调节适应性免疫反应。树突细胞成熟是诱导适应性免疫的关键，未成熟的树突细胞具有较强的内吞抗原能力，在多种刺激条件下向成熟树突细胞转化，使树突细胞表面共刺激分子(CD40、CD80和CD86)及MHC分子的表达量增加，刺激T淋巴细胞的活化及分化，同时增加促炎细胞因子分泌，促进免疫反应沿着特定的方向发展[18]。多糖通过促进树突细胞的成熟和分化，增强机体对抗原的摄取能力，从而发挥免疫佐剂效应。 川明参多糖(Chuanminshenviolaceumpolysaccharide,CVP)作为口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)疫苗佐剂，可增强树突细胞上CD40、CD80和CD86的表达，上调MHC Ⅰ/Ⅱ、TLR-2/4的mRNA水平，同时下调转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β) mRNA表达，下调CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的频率，表明CVP可通过TLR-2和TLR-4信号通路发挥免疫佐剂的效果[19]。黄芪多糖作为乙型肝炎(HBV)DNA疫苗的佐剂免疫小鼠，能显著增强特异性抗体水平的产生，促进T细胞的增殖，诱导CD4+T细胞及CD8+T细胞产生相关细胞因子，并诱导杀伤性T细胞活化，促进树突细胞成熟，同时抑制TGF-β表达和Treg细胞频率[20]。多糖被证实具有黏膜佐剂的作用，地黄多糖(Rehmanniaglutinosapolysaccharide,RGP)作为黏膜免疫佐剂，滴鼻免疫C57BL/6小鼠，可诱导小鼠纵隔淋巴结(mediastinal lymph-nodes,mLN)中C-C基序趋化因子受体7(CC-chemokine receptor 7,CCR7)上调，使树突细胞数量显著增加，并上调mLN-Dc中共刺激分子的表达和肺泡内促炎细胞因子的浓度，诱导mLN中T细胞产生IFN-γ和TNF-α[21]。

2.4 促进T淋巴细胞增殖

T淋巴细胞亚群是评价细胞免疫的关键指标，多糖通过影响T淋巴细胞的数量、比例和形态从而发挥免疫佐剂的作用。多糖佐剂功能研究较多的细胞亚群主要包括CD4+T细胞、CD8+T细胞及Treg细胞等。CD4+T细胞，即辅助性T细胞，包括Th1细胞和Th2细胞，具有辅助细胞免疫和体液免疫的功能。CD8+T细胞，即CTL细胞，其主要作用是杀死感染了病原体的宿主细胞和破坏肿瘤细胞[22]。Treg细胞具有负向免疫调节能力，可以抑制免疫系统的功能和免疫细胞活性[23]。黄芪多糖和白花蛇舌草(Hedyotisdiffusa)多糖作为免疫增强剂联合高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)灭活疫苗免疫仔猪,均能显著提高仔猪CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞的百分比和特异性抗体滴度[24]。一枝蒿(ArtemisiarupestrisL.)多糖作为FMDV疫苗佐剂免疫小鼠，增加了CD4+CD44+和CD8+CD44+有效T细胞的水平，同时显著增加了FMDV免疫小鼠脾细胞的CTL反应[25]。 肉苁蓉(Cistanchedeserticola)水提物作为多糖佐剂联合季节性流感疫苗(IVV)可促进淋巴细胞增殖，提高引流淋巴结和脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD44+T细胞的阳性率，诱导Th1型免疫应答，同时伴有CD4+T细胞和CD8+T细胞IFN-γ的诱导，激活树突细胞，降低Treg细胞的表达[26]。

2.5 促进B淋巴细胞增殖

B淋巴细胞主要参与体液免疫反应，在抗原刺激下可转化为效应B细胞(浆细胞)，合成免疫球蛋白，能与靶抗原结合的免疫球蛋白即为抗体。多糖作为佐剂可刺激B淋巴细胞的增殖。将茯苓多糖-Ⅱ(Poriacocospolysaccharide Ⅱ,PCP-Ⅱ)与灭活狂犬病病毒RCVS-11-G通过肌内注射小鼠后，对小鼠病毒中和抗体效价的提高有促进作用，还可激活腹股沟淋巴结中B淋巴细胞的增殖，激活血液中的B淋巴细胞和T淋巴细胞，刺激脾细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ[27]。磷酸化川牛膝多糖(pRCPS)作为FMDV疫苗佐剂可上调FMDV特异性IgG、IgG1、IgG2b和IgG2a抗体水平和脾细胞增殖[28]。记忆性B细胞具有再次暴露于抗原时迅速增殖分化为浆细胞并分泌抗体的能力。PCP-Ⅰ可显著提高炭疽菌特异性抗PA抗体、毒素中和抗体、抗PA抗体亲和力，以及IgG1和IgG2a水平。PCP-Ⅰ可增加PA特异性记忆B细胞的频率，增加PA特异性脾细胞的增殖，显著刺激IL-4的分泌，增强树突细胞的活化[29]。

3 多糖对免疫分子的作用

3.1 刺激细胞因子的产生

细胞因子在功能性免疫系统的发育和机体对感染的反应中都起着重要作用。多糖刺激细胞产生的细胞因子按功能划分为Th1型细胞因子(IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-β等)与Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等)[30]。Th1细胞主要促进细胞介导的免疫，而Th2细胞以促进抗体产生为主[31]。常用的铝佐剂只能诱导Th2型免疫应答，理想的佐剂应能同时诱导Th1型及Th2型的免疫反应。由表1可知，许多多糖佐剂能刺激机体产生IL、IFN、TNF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)等细胞因子，通过使免疫反应向Th1/Th2型免疫反应改变，从而改变疫苗的免疫特性。

3.2 促进抗体的产生

抗体是B淋巴细胞在抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的免疫球蛋白。抗体可特异性地与抗原结合，发挥免疫作用。哺乳动物免疫球蛋白分为IgG、IgM、IgA、IgE及IgD。IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白，具有抗菌、抗病毒、抗毒素等特性，对毒性产物起中和、沉淀、补体结合作用，IgG1滴度可反映Th2免疫反应的强度，IgG2a、IgG2b和IgG3抗体滴度可反映Th1免疫反应的强度。IgA主要由呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道等处黏膜固有层中的浆细胞合成，是机体黏膜防御感染的重要因素[33]。IgM是机体被感染后最先出现的抗体，具有强有效的病毒清除作用[36]。多糖佐剂可诱导IgG、IgA、IgM等抗体的生成，发挥特异性的免疫作用(表1)。

4 多糖相关受体及信号通路

多糖作为兽用疫苗佐剂，不仅能促进抗原特异性免疫系统，还能增强机体的自然免疫功能，通过对先天性免疫反应的激活，产生刺激和引导随后的适应性免疫反应信号，从而发挥佐剂作用。 多糖通常是以病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)识别免疫细胞上的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)，进而活化免疫细胞，促进细胞因子的释放，介导机体免疫反应[38]。多糖作为配体主要与Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)、C型凝集素受体(C-type lectin-like receptor，CLR)、补体受体3(complement receptor 3,CR3)、清道夫受体(scavenger receptor,SR)等受体分子结合[39]。

4.1 TLR

TLR是主要在宿主抗原提呈细胞(APCs)中表达的PRRs，并在决定致病性感染中发挥关键作用。TLR家族的10个成员(TLR1～TLR10)中能与多糖相互作用的TLRs主要是TLR4和TLR2。

4.1.1 TLR4 TLR4是目前研究最广泛的一类PRRs，它不仅在免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞中表达，还表达于内皮细胞、心肌细胞等多种细胞中。其配体包括革兰氏阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、脂寡糖、细菌内毒素和病毒、真菌和霉菌分泌物质[40]。其介导的植物多糖糖链主要由α-(1→3)和α-(1→6)构型组成，通过介导髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依赖与非依赖两种途径，促进核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)、 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的激活，进而促进IL-1、IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子的产生[41]，从而产生强有力的炎症反应。

4.1.2 TLR2 TLR2常表达于巨噬细胞、树突细胞、单核细胞等抗原递呈细胞的表面，能识别多种病原体，是识别范围最广的TLR，其配体有革兰氏阳性菌的脂蛋白、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)、脂磷壁酸(lipteichoic acid，LTA)、阿拉伯甘聚糖(lipoarabinomannan，LAM)、酵母聚糖(zymosan)等[42]。TLR2可与大部分配体直接结合诱导免疫应答，但对PGN的识别还需要TLR1与TLR6的参与[43]。TLR2介导的植物多糖的糖链主要由α(1→3)或β(1→4)构型组成，通过MyD88依赖途径激活NF-κB或磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase,AKT)信号通路通路，导致IRF3、IRF7、AP-1和NF-κB等促炎因子的磷酸化和激活，发挥抗菌、抗病毒和抗肿瘤的作用[44]。

4.2 CLR

CLR是一个大的蛋白超家族，具有一个或多个相关的C型凝集素样结构域(CTLDs)。CLR具有Ca2+依赖性，通过其碳水化合物识别域(carbohydrate recognition domain,CRD)识别多糖[45]。 识别的多糖主要含有α-(1→3)、α-(1→4)、β-(1→3)和β-(1→4) 型的糖苷键。CLR中主要作用于多糖的受体包括甘露糖受体(mannose receptor,MR)、Dectin-1、Dectin-2、Dectin-3等。

4.2.1 MR MR属于钙依赖性Ⅰ型跨膜蛋白受体。MR既能识别巨噬细胞、内皮细胞和树突细胞等细胞表达的内源性分子，又能识别病原体，它是连接固有免疫和适应性免疫之间的桥梁。MR识别的配体主要有L-岩藻糖、D-甘露糖和D-N-乙酰葡萄糖胺等[46]。MR通过胞外结构域识别和结合许多内源性配体，通过内吞作用和吞噬作用将其内化和降解，从而维护内环境的稳定[47]。MR需其他受体共同参与完成信号转导，激活转录，促进IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、GM-CSF、IL-10等细胞因子的表达，发挥免疫防御、免疫稳定、免疫监视的功能[48]。

4.2.2 Dectin-1 Dectin-1受体是一种Ⅱ型CLR，主要介导具有β-(1→3)和β-(1→6)构型的葡聚糖配体，被称为β-葡聚糖受体。因β-葡聚糖是真菌细胞壁的主要成分，所以Dectin-1受体也可作为真菌的主要模式识别受体。Dectin-1存在于髓系细胞上，包括巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞，它也存在于某些淋巴细胞上，如γδT细胞[49]。 Dectin-1介导的下游信号通路分为脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)的NF-κB信号通路和非Syk的NF-κB通路，以及其他与Dectin-1受体下游信号相互作用的通路[50]。Dectin-1也可增强TLR4及TLR2介导的信号传导，促进细胞因子分泌。这诱导了多种细胞反应，包括呼吸爆发、磷脂酶A2(PLA2)和环氧化酶2(COX2)的激活和调节、内吞和吞噬的配体摄取及多种细胞因子和趋化因子的产生，包括TNF、巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)、IL-2、IL-10、IL-6和IL-23。

4.2.3 Dectin-2与Dectin-3 Dectin-2是一种Ⅱ型CLR，广泛存在于巨噬细胞上。 最初鉴定Dectin-2所识别的多糖均含有甘露糖成分，含ITAM的衔接蛋白(如FcRγ)相互作用，诱导多个信号转导级联，然后通过Syk和CARD9依赖途径激活NF-κB，诱导Th17的分化，细胞因子如TNF-α、IL-2、IL-10、IL-23、IL-1β、IL-6和IL-12等介导机体免疫应答[51]。Dectin-3能识别某些真菌的α-甘露聚糖，与Dectin-2分子的作用机制相同[52]。

4.3 CR3

在免疫系统的细胞中，最丰富的补体受体是CR3。CR3属于黏附分子整合素家族中的成员，是最重要的吞噬受体之一，主要与β-葡聚糖结合。CR3在单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、NK细胞及T淋巴细胞和B淋巴细胞的某些亚群上表达[53]。 CR3介导的活化需要黏附斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、Syk、PI3K、Akt、p38MAPK、磷脂酶C(phospholipaseC,PLC)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)，可使NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞处于预激活化状态，然后通过补体iC3b的纽带作用使效应细胞和靶细胞相互结合，杀伤靶细胞[54]。

4.4 SR

SR主要表达于巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、小胶质细胞和B淋巴细胞上，同时也在内皮细胞和上皮细胞中表达。 SR最初是根据它们结合修饰的低密度脂蛋白(LDL)的能力来识别和分类的，根据其序列相似性或共同的结构特征被分为A～J 10类，具有结合LPS和磷脂酰丝氨酸的能力。SR具有广泛的功能，如清除病原体、凋亡细胞清除、脂质运输、细胞黏附、细胞内货物运输，甚至是味觉感知。SR所识别的多糖可具有α-和β-构型，通过激活PLC，随之激活 PKC和P13K，导致 MAPK、ERK 及NF-κB 激活，致使下游相关基因表达[55]。

由表2可知，不同多糖因其结构和组成不同，所结合的受体种类和其作用机制也不相同。

5 小结与展望

目前兽用疫苗中主要依赖铝佐剂或油佐剂，多糖作为植物来源天然产物具有毒性低、副作用小等优点，作为疫苗佐剂具有广泛的应用前景。近些年人们对多糖进行了广泛的研究，但只有少数可实际应用于临床中，主要是因为多糖具有纯度低、质量标准不易控制、分子结构不明确、影响其生物活性因素多、具有量效关系等缺点，从而限制了其应用。今后多糖的研究趋势主要以广泛筛选可应用的天然多糖并开展佐剂效果评价，对其佐剂机制进行深入研究，与其他佐剂配伍作用的可能性与作用机制的研究，以及对其结构的解析和构效关系的研究等内容着手，深入系统地研究多糖的佐剂作用，使人们从更多的角度认识并应用多糖。