HPLC法测定硫酸庆大霉素滴眼液中8种抗氧剂

卢玉凤 张振中

摘要：目的 建立硫酸庆大霉素滴眼液中8种抗氧剂含量的HPLC测定方法，考察包材中抗氧剂向药液的迁移情况。方法 采用Inertsil ODS-3色谱柱（4.6 mm×100 mm，3 μm）；检测波长：200 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样量：10 μL；流动相为水-乙腈，梯度洗脱。采用正己烷对样品中的抗氧剂进行提取，建立硫酸庆大霉素滴眼液中抗氧剂BHA、抗氧剂XH-245、抗氧剂BHT、抗氧剂3114、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076和抗氧剂168含量的测定方法，并进行方法学验证，同时测定了企业提供的原辅料和包材中8种抗氧剂的含量，并对制剂进行了影响因素考察试验。结果 8种抗氧剂之间的分离度良好，均在0.3～30 μg/mL 浓度范围内线性关系良好（r≥0.9994）。方法精密度、重复性、回收率、稳定性均符合有关规定。硫酸庆大霉素滴眼液、原辅料中均未检出8种抗氧剂，包材中仅检出抗氧剂BHT，影响因素试验表明样品中8种抗氧剂的迁移不受高温、高湿和强光照射的影响，表明本品由包材中抗氧剂迁移带来的安全风险较低。结论 所建立的方法灵敏、快速、准确、重复性好，提取方法简单，可用于硫酸庆大霉素滴眼液中8种抗氧剂迁移情况的监测和溯源。

关键词：高效液相色谱法；硫酸庆大霉素滴眼液；抗氧剂；原辅料；包材

中图分类号：R978.1， R917文献标志码：A

Determination of eight antioxidants in gentamicin sulfate eye drops by HPLC

Lu Yu-feng1，2， and Zhang Zhen-zhong1

（1 Zhengzhou University， Zhengzhou 450001; 2 Institute for Food and Drug Control of Henan Province， Zhengzhou 450018）

Abstract Objective To establish an HPLC method for determining the content of eight antioxidants in gentamicin sulfate eye drops， and study the migration of antioxidants from plastic packaging materials to eye drops. Methods HPLC was performed on an Inertsil ODS-3 column（4.6 mm×100 mm， 3 μm）with the mobile phase of acetonitrile-water（gradient elution）. The flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was 200 nm， the column temperature was maintained at 30℃， and the sample volume was 10 μL. The antioxidant in the sample was extracted with n-hexane. The HPLC method was set up to determine the contents of antioxidant BHA， XH-245， BHT， 3114， 1010， 330， 1076， and 168. At the same time， the contents of eight antioxidants in the preparations， raw and auxiliary materials， and packaging materials provided by the enterprise were determined， and the influencing factors of the preparations were investigated. Results The eight antioxidants were well separated， which showed good linear relationship in the concentration range of 0.3～30 μg/mL（r≥0.9994）. The specificity， the precision， the accuracy， and the robustness were good. Conclusions The method is sensitive， rapid and accurate with good repeatability， which can be used to evaluate the migration of antioxidants from packaging materials and containers to gentamicin sulfate eye drops.

Key words HPLC; Gentamicin sulfate eye drops; Antioxidant; Raw and auxiliary materials; Packaging materials

硫酸慶大霉素滴眼液常采用了塑料药品包装材料，而此类包装材料在生产过程中，为使其易于加工，在储存、使用过程中更加稳定，常需加入酚类、亚磷酸酯类或硫酯类抗氧剂。常用的抗氧剂BHA、BHT，毒副作用较大，对人体肝、脾、肺等均有不利影响；其他大多数抗氧化剂稳定作用良好而且无毒，然而，由于苯基的存在，一些苯基取代的亚磷酸酯类被认为具有一定毒性；此外，抗氧剂168的主要氧化裂解产物邻苯二甲酸丁二酯，毒理学试验证明其有潜在的致癌作用。并且在包材使用过程中，抗氧剂与药液接触时发生相互作用或直接迁移至药液时，会影响药效的发挥甚至危及人体健康。因此，有必要对药品中的抗氧剂含量进行考察，进一步提高药品质量，保障人民用药安全。本试验参考英国药典（BP2021）[1]、欧洲药典（EP10.0）[2]及相关文献[3-9]，采用正己烷提取样品中的抗氧剂，建立HPLC法测定硫酸庆大霉素滴眼液中8种抗氧剂含量的方法，并进行方法学验证，该方法检测限低，前处理过程简单，方法可靠，为药包材的质量研究以及药物与药包材的相容性试验提供了参考方法。按建立的方法测定了硫酸庆大霉素滴眼液2021年国家药品抽检样品23批次样品、企业调研样品3批次、对照制剂2批次、2家企业提供的原辅包和影响因素试验样品中8种抗氧剂的含量，并对测定结果进行了分析和评估。

1 仪器与试药

1.1 药品与试剂

抗氧剂BHA（批号：LJ80U71）、抗氧剂330（批号：LF70T68）、抗氧剂1010（批号：LK20V115）、抗氧剂1076（批号：LRB0U122）、抗氧剂168（批号：L990U58）购自河北百灵威超精细材料有限公司，质量分数均>98%；抗氧剂XH-245（批号：2787-01，质量分数：100.0%）购自AccuStandard公司；抗氧剂BHT（批号：BCCC0032，质量分数：99.0%）购自Aldrich公司；抗氧剂3114（批号：VQKUH-NY，质量分数：98.0%）购自东京化成工业株式会社。硫酸庆大霉素（批号：190510010）、硼砂（批号：200908）、硼酸（批号：201102）、羟苯乙酯（批号：103620201001）均由A企业提供；硫酸庆大霉素滴眼液，2021年国家药品抽检样品23批次和企业调研样品3批次均由A、B两家企业生产，见表1；硫酸庆大霉素滴眼液（批号L20A9G）购自日本株式会社日本点眼药研究所；硫酸庆大霉素滴眼液（批号：T0274）购自美国Allergan公司。

低密度聚乙烯药用滴眼剂瓶（批号：20100053）由A企业提供；低密度聚乙烯药用滴眼剂瓶（批号：190605）由B企业提供；色谱级乙腈购自Sigma公司；色谱级正己烷购自VBS Biologic公司；超纯水由Millipore纯水仪制备。

1.2 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2489紫外检测器（美国Waters公司）；Waters 2998二极管阵列检测器（美国Waters公司）；XPE 205型电子天平（美国Mettler公司）；MS3 basic型涡旋振荡器（德国IKA公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Inertsil ODS-3色谱柱（4.6 mm×100 mm，3 μm）；检测波长：200 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样量：10 μL；A相：水，B相：乙腈，按表2进行梯度洗脱。

2.2 对照品溶液的制备

混合对照品溶液：取8种抗氧剂对照品10 mg，精密称定，加乙腈1 mL，加正己烷适量，超声使溶解，用正己烷稀释并制成各约含100 μg/mL的混合对照品贮备液，再用正己烷稀释制成含8种抗氧剂分别为0.3、0.5、1.0、5.0、8.0、10.0、12.0、20.0和30.0 μg/mL的混合对照品溶液1～9，其中对照品溶液6（10.0 μg/mL）作为系统适用性溶液。

2.3 空白溶液、原料溶液、辅料溶液、供试品溶液和重复性溶液的制备

空白溶液：正己烷。

原料溶液：按处方取硫酸庆大霉素原料适量，精密称定，加水溶解并定容至50 mL，得相当于庆大霉素5 mg/mL的溶液。取该溶液8 g，精密称定，置具塞玻璃试管中，精密加入正己烷2 mL，涡旋振荡2 min后，静置2 min，取正己烷层作为原料溶液。

辅料溶液：综合两家企业的处方，按比例称取各辅料适量，精密称定，按处方加水溶解并定容至50 mL。取该溶液8 g，精密称定，置具塞玻璃试管中，精密加入正己烷2 mL，涡旋振荡2 min后，静置2 min，取正己烷层作为辅料溶液。

供试品溶液：取硫酸庆大霉素滴眼液8 g，精密称定，置具塞玻璃试管中，精密加入正己烷2 mL，涡旋振荡2 min后，静置2 min，取正己烷层作为供试品溶液。

重復性溶液：取同一批硫酸庆大霉素滴眼液6瓶，分别取8 g，精密称定，置具塞玻璃试管中，精密加入2 mL混合对照品溶液3，涡旋振荡2 min后，静置2 min，取正己烷层作为供试品溶液。

2.4 系统适用性试验

精密量取系统适用性溶液进行测定， 8种抗氧剂出峰顺序依次为：抗氧剂BHA、抗氧剂XH-245、抗氧剂BHT、抗氧剂3114、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076和抗氧剂168。色谱图中8种抗氧剂及相邻峰之间的分离度均大于1.5，本试验方法的色谱条件可行，系统适用性溶液色谱图见图1。

2.5 专属性试验

分别取“2.3”中空白溶液、原料溶液、辅料溶液作为阴性对照溶液，同时取供试品溶液按“2.1”方法进行测定，结果显示硫酸庆大霉素和各辅料均在4 min之前出峰，溶剂正己烷和原料、辅料均不干扰8种抗氧剂的测定，该方法专属性良好，见图2阴性对照溶液色谱图和图3供试品溶液色谱图。

2.6 线性与范围

分别精密量取“2.2”中混合对照品溶液1～9，按“2.1”方法进行测定，8种抗氧剂线性与范围结果见表3，8种抗氧剂的峰面积与浓度的线性关系均良好。

2.7 精密度试验

2.7.1 进样精密度

精密量取“2.2”中混合对照品溶液6连续进样，8种抗氧剂峰面积的RSD在0.61%～1.05%（n=6），表明该方法进样精密度良好。

2.7.2 重复性

取同一批次硫酸庆大霉素滴眼液6瓶，按“2.3”方法分别制备供试品溶液并进行测定，结果供试品溶液中，均未检出8种抗氧剂。另取同一批次硫酸庆大霉素滴眼液6瓶，按“2.3”方法分别制备重复性溶液，8种抗氧剂峰面积的RSD均在0.54%～1.85%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.7.3 中间精密度

取同一批次硫酸庆大霉素滴眼液，在不同日期、由不同分析人员按“2.3”方法分别制备重复性溶液6份，使用不同仪器测定，8种抗氧剂峰面积的RSD均在0.91%～1.78%（n=6），表明说明该方法中间精密度良好。

2.8 检测限与定量限

精密量取“2.2”中混合对照品溶液6用正己烷逐级稀释，以信噪比S/N约为3：1计为检测限，以信噪比S/N约为10：1计为定量限，检测限与定量限结果见表4。

2.9 稳定性试验

将混合对照品溶液6和供试品溶液和重复性溶液在室温下放置，分别在0、2、4、6、8、10和12 h进样测定，对照品溶液中8种抗氧剂峰面积的RSD%在1.12%～1.71%，表明对照品溶液在12 h内稳定性良好。供试品溶液在12 h内均未检出8种抗氧剂，重复性溶液在12 h内8种抗氧剂峰面积的RSD在0.61%～1.63%，重复性溶液稳定性良好。

2.10 加样回收率试验

取同一批次硫酸庆大霉素滴眼液9瓶，分别称取8 g置具塞试管中，再分别精密加入“2.2”中混合对照品溶液（8 μg/mL）、混合对照品溶液（10 μg/mL）和混合对照品溶液（12 μg/mL）各2.0 mL，涡旋振荡2 min后静置2 min，取正己烷层作为加样回收率溶液。（各浓度平行配制3份，共9份）。按“2.1” 方法进样测定，各抗氧剂的平均回收率在91.9%～102.2%，RSD在0.30%～1.41%，回收率良好，结果见表5。

2.11 耐用性

取“2.2”中混合对照品溶液6，以8种抗氧剂的保留时间和各峰之间的分离度为指标，采用不同色谱柱、不同柱温、不同流速考察方法耐用性。

（1）色谱柱

选用品牌、内径、柱长和粒径不同的C18色谱柱，色谱柱信息见表6，不同色谱柱系统适用性溶液色谱图见图4，结果显示优先选择内径4.6 mm、柱长100 mm或150 mm、填料粒径3 μm的色谱柱，8种抗氧剂色谱峰能在分析时间内全部出峰并达到良好的分离效果。

（2）柱温

采用Inertsil ODS-3（4.6 mm×100 mm，3 μm）色谱柱，柱温分别为30℃、35℃和40℃，其他色谱条件相同。精密量取系统适用性溶液分别进样测定，结果表明不同的柱温条件下，系统适用性溶液中8种抗氧剂各峰之间的分离度均大于1.5。但柱温为30℃时，抗氧剂168出峰较晚（接近50 min），因此建议柱温应高于30℃。

（3）流速

采用Inertsil ODS-3（4.6 mm×100 mm， 3 μm）色谱柱，流速分别为0.8、1.0和1.2 mL/min，其他色谱条件相同。精密量取系统适用性溶液分别进样测定，结果表明不同的流速条件下，系统适用性溶液中8种抗氧剂各峰之间的分离度均大于1.5。但流速为0.8 mL/min时，抗氧剂168出峰较晚（接近50 min），因此建议流速应大于0.8 mL/min。

3 样品测定

3.1 硫酸庆大霉素滴眼液测定

按建立的方法对本次国家药品抽检23批次和企业调研3批次硫酸庆大霉素滴眼液样品及日本、美国2批次对照制剂中8种抗氧剂的含量进行测定，供试品溶液典型色谱图见图3，按“2.6”中线性方程计算各批次样品中8种抗氧剂的含量。结果为两家企业共26批次样品及日本、美国2批次对照制剂中8种抗氧剂的含量均低于检测限，均未检出。根据参考文献[3-4]及毒性数据库的相关资料，获知抗氧剂BHT、3114、1010、1076、168的PDE（每日允许最大暴露量）分别为0.15、25、10、0.3和2.5 mg/d，抗氧剂BHA、XH-245和330根据结构类似，毒性类似的原则，分别参考BHT、1076和3114的PDE值，推定其PDE值分别为0.15、0.3和25 mg/d用于安全评估。由本品说明书推算本品单眼每日最大使用量为10滴，约相当于0.5 g/d，假设8种抗氧剂按照PDE的全量迁移至药液中，推算8种抗氧剂的分析评价阈值（AET）=PDE×天数（1）÷药液重量（0.5 g）范围为：0.3～50 mg/g。本次国家药品抽检样品中均未检出8种抗氧剂，表明本品由8种抗氧剂带来的安全风险较低。

3.2 原辅料测定

按“2.3”中配制原料溶液和辅料溶液，按建立的方法进行测定，按“2.6”中线性方程计算原辅料中8种抗氧剂的含量，结果为2家制剂生产企业提供的原辅料中8种抗氧剂的含量均低于检测限，均未检出。

3.3 包材测定

取包材10套，剪至大小约为0.2 cm×0.2 cm的单个碎片，混匀。精密称取包材碎片约2 g，分别用正己烷20 mL煮沸回流4 h提取、乙腈20 mL煮沸回流4 h[5]提取、异丙醇超声4 h后浸泡过夜提取[6]3种方式提取包材中的8种抗氧剂，按建立的方法进行测定，按“2.6”中線性方程计算。结果：①2家生产企业提供的包材中均检出BHT，而硫酸庆大霉素滴眼液中未检出，表明包材中BHT未迁移入样品中，分析为8种抗氧剂在水中不溶或微溶，因此不易迁移入药液中。②对比提取结果，可知用正己烷提取包材中8种抗氧剂，检出BHT含量较高，提取效果好。分析为用乙腈或异丙醇提取时，包材无形态变化，提取溶液澄清。而用正己烷提取时，包材被正己烷溶解破坏，发生形态变化，抗氧剂易于提取到正己烷中，提取溶液为白色浑浊溶液，因此用正己烷提取包材中抗氧剂效果好，结果见表7包材测定结果。

3.4 影响因素试验样品测定

取2家生产企业的硫酸庆大霉素滴眼液各1批次和日本、美国对照制剂分别置高温（60℃）、高湿（25℃，硝酸钾饱和溶液，相对湿度：92.5%）和强光（照度：4500 Lx）环境下，置高温条件下的样品在0、5、10和30 d时分别取样，置高湿和强光条件下样品在0、5和10 d时分别取样。按“2.3”中方法配制相应的供试品溶液，按建立的方法进行测定，按“2.6”中线性方程计算。结果为2家生产企业的硫酸庆大霉素滴眼液和日本、美国的对照制剂，供试品溶液中8种抗氧剂的含量均低于检测限，均未检出，不受高温、高湿和强光照射的影响。

4 讨论

4.1 提取溶剂的选择

根据抗氧剂BHA、抗氧剂XH-245、抗氧剂BHT、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076和抗氧剂168均不溶于水，抗氧剂3114微溶于水，但在有机溶剂中均有一定的溶解性的特点。分别称取8种抗氧剂适量，用乙腈、异丙醇和正己烷进行溶解度试验，观察溶解情况。结果发现8种抗氧剂在乙腈中溶解性最好，异丙醇和正己烷次之，拟选乙腈为溶剂。

4.2 提取方式的选择

本品为硫酸庆大霉素的水溶制剂，8种抗氧剂不溶或微溶于水，需经有机溶剂提取后方可测定，对提取方式进行了考察。

4.2.1 固相萃取

选用乙腈为溶剂时，因乙腈与水互溶，需用固相萃取小柱对样品的抗氧剂进行富集后，用乙腈洗脱，并收集洗脱液作为供试品溶液；对照品用乙腈溶解并稀释配制成混合对照品溶液[7]。

4.2.2 正己烷提取

选用正己烷为溶剂时，正己烷和水不互溶，可利用抗氧剂不溶于水或微溶于水，可溶于正己烷的特点，将样品中的抗氧剂提取至正己烷层，取正己烷层作为供试品溶液；对照品用正己烷溶解并稀释配制成混合对照品溶液（注：抗氧剂XH-245在正己烷中溶解度较差，因此配制对照品贮备液时需先加入适量乙腈助溶）。

精密量取以上两种提取方式配制的混合对照品溶液和供试品溶液进样，结果显示，用乙腈和正己烷分别配制的混合对照品溶液的色谱图中，8种抗氧剂的保留时间和峰形基本一致，分离度均符合要求。两种提取方式所得供试品溶液测定结果一致。但采用固相萃取提取方式时，需先对萃取小柱进行活化，且富集样品耗时长，而采用正己烷提取时，供试品溶液制备方法简单快速。为了快速高效地完成试验，本试验选用正己烷提取的方式制备供试品溶液。

4.3 检测波长的选择

精密量取系统适用性溶液，采用二极管阵列检测器进行采集，8种抗氧剂均在200 nm波长处有较大吸收，峰响应好，因此选用200 nm为检测波长。

参 考 文 献

[1]The British Pharmacopoeia 2021[S]. The British Pharmacopoeia Commission， 2020（V）： 668-685.

[2]The European Pharmacopoeia 10.0th Edition[S]. European Directorate for the Quality of Medicines and Healthcare（EDQM）， 2020（I）： 423-436.

[3]张旭， 傅萍， 谢华， 等. HPLC法同时测定药用卤化丁基胶塞中17种抗氧剂向注射用伏立康唑中的迁移[J]. 药物分析杂志， 2020， 40（8）： 1481-1489.

[4]马玉楠， 马磊， 蒋煜. 药品与包装材料相容性研究相关指导原则解读——试验结果的评估[J]. 中国新药杂志， 2014， 23（8）： 940-943.

[5]蔡心怡， 王悦雯， 冯靖， 等. 药品包装材料用塑料粒料中8个常用抗氧剂的含量测定[J]. 药物分析杂志， 2020， 40（3）： 523-528.

[6]靳貴英， 王彩媚， 莫湫萍， 等. HPLC法同时测定药品塑料包装材料中五种抗氧剂的含量[J]. 中国医药科学， 2018， 8（17）： 62-65.

[7]张冬梅， 于明艳， 刘文坤， 等. HPLC考察妥布霉素滴眼液中11种抗氧剂[J]. 中国现代应用药学， 2020， 37（15）： 1862-1866.

[8]饶艳春， 熊炜， 朱碧君. HPLC法同时测定3种材质药用塑料瓶中5种抗氧剂含量[J]. 中国医药导报， 2019， 16（25）： 27-31.

[9]王丽， 赵锐， 田恩圣， 等. 35批次头孢类抗生素注射用粉针丁基胶塞中游离硫及常见抗氧剂的迁移研究[J]. 药物分析杂志， 2020， 40（11）： 2033-2041.