噬菌体与抗生素的联合应用及其协同作用机制

邵健健?杜红旭?曲逸文?毕师诚?张莹莹?马跃

摘要：抗生素滥用已导致全球范围内的抗生素耐药危机，人们不得不开始寻求新的策略解决这一问题。古老的噬菌体疗法因噬菌体杀菌效力强、可自我复制等优势而重新受到重视。但单独使用噬菌体可能面临一系列问题，如抗菌谱过窄，噬菌体抗性及免疫原性等。噬菌体与抗生素联合应用能够协同裂解宿主细菌，更好地控制或根除细菌感染，因此，二者联用在近年来开始成为噬菌体疗法的研究和应用热点。本文通过整理噬菌体与抗生素联合应用的研究文献及临床报道，探讨、总结噬菌体与抗生素的协同作用机制，以期进一步推动噬菌体与抗生素联合的研究与应用。

关键词：噬菌体；抗生素；裂解量；裂解酶；外排泵；生物膜

中图分类号：R978.1，Q939.48文献标志码：A

Combined application and its synergistic mechanisms of bacteriophages

and antibiotics

Shao Jian-jian， Du Hong-xu， Qu Yi-wen， Bi Shi-cheng， Zhang Ying-ying， and Ma Yue

（College of Veterinary Medicine， Southwest University， Chongqing 402460）

Abstract Overuse and misuse of antibiotics have led to a worldwide crisis of antibiotic resistance， and new strategies are demanded to solve the problem. Old bacteriophage therapy has been reconsidered as a therapeutic option due to high bactericidal efficacy and self-replication of bacteriophages. Using bacteriophages alone，however，faces a series of challenges， such as narrow antibacterial spectrum， bacteriophage resistance and immunogenicity. In recent years， the combination of bacteriophage and antibiotic began to become a hotspot of bacteriophage therapy because they can synergistically lyse the bacteria and lead to eradication of bacterial infections. The primary objective of this review is to discuss and generalize the synergistic mechanisms of bacteriophage and antibiotic combinations by sorting out related researches and clinical reports， so as to promote bacteriophage-antibiotic researches and applications.

Key words Bacteriophage; Antibiotics; Burst size; Endolysins; Efflux pump; Biofilm

在临床和养殖业中长期过度使用抗生素已导致全球范围内的抗生素耐药危机[1]。全球每年有超过70万人因耐药细菌感染而死亡[2]，预计到2050年，每年将会有1000万人死于耐药细菌感染，超过因癌症死亡的人数[3]。开发或寻找新抗生素耗时且昂贵，整个过程需要10至15年[4]，20世纪80年代以来只发现了3种新的抗生素类别[5]。新型抗生素研发速度减缓要求人们寻找新的策略解决这一问题。

噬菌体（bacteriophage）是生物界最丰富的生物群体，能够感染细菌并进行复制，具有杀菌特异性强、开发成本低、易于分离、自我限制、副作用少以及可杀灭耐药性菌株等潜在优点[2，6]。 近年来抗生素耐药危机使噬菌体疗法再次成为研究热点，但其临床疗效可能受到以下因素的制约：①免疫原性[7-9]，②噬菌体抗性[2]，③抗菌谱较窄，现有的解决方法有：①噬菌体鸡尾酒（bacteriophage cocktail），②個性化噬菌体疗法[10]，③基因工程改造噬菌体，如突变尾丝蛋白[11]、掺入异源受体结合域[12]等。

鉴于抗生素耐药性增加及单独使用噬菌体的局限，噬菌体和抗生素联合应用可能是更加合理且有效的方法，因为①两个足够且不同的压力可能比单一压力更加有效，②联合应用可减少抗生素使用量，降低抗生素耐药危机，③减少噬菌体抗性菌株的出现，④有效控制继发和其他非主要病原菌感染。本文总结了噬菌体与抗生素之间协同作用的机制，提出在噬菌体与抗生素联合应用中，既存在抗生素协同噬菌体，也存在噬菌体协同抗生素作用的现象。

1 抗生素协同噬菌体

1.1 抗生素增加噬菌体裂解量

噬菌体侵染细菌后会在细胞内部复制，并选择合适的时机释放病毒子代，进一步感染周围细菌。但当环境中噬菌体数量多于细菌，不适合噬菌体子代释放时，多个噬菌体会吸附至同一细菌，导致细菌延迟裂解[13]，噬菌体复制时间延长，裂解量（burst size， 指每个菌体中产生的噬菌体数量）增加，同时子代噬菌体会避免吸附至已被感染的细菌，这种现象叫噬菌体“超感染”（superinfection）[14]（图1）。

Comeau等[15]发现，经头孢噻肟处理后细菌出现丝状化（bacterial filamentation），噬菌斑（plaque）显著增大，噬菌体滴度增加，表现出协同作用。许多学者在不同的噬菌体与抗生素组合（如噬菌体KS12、KS14与美罗培南、环丙沙星和四环素[16]；噬菌体σ-1与头孢曲松[17]）中报道了相似的效应。某些细菌在抗生素处理后形态会发生改变[18]，抗生素可作为一种外源施加的压力诱导细菌延迟裂解，增加噬菌体裂解量[19]。这种现象可能与噬菌体裂解过程相关。噬菌体裂解细菌的整个过程分为3个步骤，分别对应内膜、肽聚糖和外膜的破坏。常规裂解中，Holin蛋白（穿孔素）在細胞质膜中无害累积，在特定时间触发以形成微米级别的空隙，为裂解肽聚糖做准备[20]。Kim等[19]研究表明，当细菌细胞呈丝状生长时，细菌长度增加15.4倍，而Holin蛋白仅增加2.1倍，导致相对面积内Holin蛋白的积聚时间延长，噬菌体装配时间增加，最终导致噬菌体数量暴发。部分抗生素能引起细胞丝状化，使细胞壁弱化或细菌分裂不良[21]，模拟细菌延迟裂解过程的发生。但仍有文献表明，细菌丝状化并不一定导致噬菌体和抗生素协同作用发生[17]，这可能涉及到另外的因素和机制。但可以肯定的是，抗生素能使细菌的生长状态欠佳，使噬菌体的侵染更具威胁。

1.2 抗生素增强噬菌体裂解酶外部裂解细菌

研究发现，噬菌体滴度与噬菌斑大小并不呈正相关，即某些噬菌体的滴度较低，但仍能产生较大的噬菌斑，这可能与噬菌体裂解酶（bacteriophage endolysins）相关。噬菌体裂解酶是噬菌体在宿主细菌体内复制后期合成的蛋白质[22]，能够裂解细胞壁肽聚糖中的重要化学键，导致细菌菌体破裂，释放出子代噬菌体。从外部靶向使用裂解酶可以破坏正常革兰阳性菌的细胞壁，使细菌成级数死亡[23]。研究表明，裂解酶能够消化肽聚糖，在细胞壁上形成孔洞，从而发挥其抗菌活性[24]。此外，裂解酶并不局限于靶向细胞壁，在裂解酶作用后可发现细菌细胞膜损伤，质膜通透性增加[25]。在过去，裂解酶的研究主要针对革兰阳性菌，革兰阴性菌由于其外膜阻止裂解酶进入肽聚糖层，效果并不理想[22]。近期已有研究表明，裂解酶Ply17、EL188等与外膜渗透剂（outer membrane permeabilizer）联合应用时对革兰阴性菌有较好效果[26-27]，甚至部分裂解酶如Ply6A3、PlyF307和LysPA26等能够不依赖外膜渗透剂直接裂解革兰阴性细菌[28-30]。裂解酶能够直接裂解革兰阴性菌的活性可能归因于其尾部的两亲性螺旋[23]，这一结构可以协助裂解酶穿透细胞膜。将包含两亲性螺旋的C末端区域删除会显著降低裂解酶LysAB2的抗菌活性，并且与完整的鲍曼不动杆菌噬菌体裂解酶分子相比，它的C末端区表现出更强的杀菌活性[25]。

部分裂解酶不仅能裂解其目标宿主菌，还可以有效杀灭非直接靶向病原菌[28，30]，它们的抗菌谱介于噬菌体和抗生素之间，能够有效克服噬菌体高度特异性而不能用于治疗多种病原菌混合感染的困难。某些情况下，裂解酶与抗生素表现出协同作用。裂解酶Cpl-711与头孢噻肟协同作用杀灭多重耐药肺炎球菌[31]；多黏菌素B对大肠埃希菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations， MIC）为0.6～1 ?g/mL，与T5噬菌体裂解酶联合应用后，其MIC降低至0.4～0.5 ?g/mL[32]；SAL200降低抗生素的MIC，在体内外均表现出协同作用[33]。噬菌体裂解酶Cpl-1、Clys、LysABP-01和MR-10与抗生素联合应用时也出现协同作用[34-37]。噬菌体裂解细胞后会将子代噬菌体和裂解酶释放入周围环境中，抗生素让细胞壁或细胞膜缺损，使环境中的裂解酶从外部顺利抵达肽聚糖并发挥裂解细胞的作用。与抗生素相比，不同裂解酶靶向肽聚糖中的不同化学键，细菌对裂解酶耐受的可能性较常规抗生素低了几个数量级[38-39]。

1.3 抗生素抑制噬菌体抗性菌株的出现

噬菌体抗性菌株的出现是目前噬菌体疗法面临的主要问题，临床常使用噬菌体鸡尾酒来减少噬菌体抗性菌株的出现，但是这些噬菌体混合物需要更长的时间进行制备、纯化，增加引起免疫反应的可能，并降低噬菌体药代动力学和药效学的可预测性[2，40]。噬菌体与抗生素联合应用也许能更好地解决这个问题。Kirby等[41]发现噬菌体SA5与庆大霉素联合应用可减少金黄色葡萄球菌的数量，与单独使用噬菌体处理不同，噬菌体与抗生素联合应用中未检测到噬菌体抗性菌株。Oechslin等[42]在心内膜炎大鼠模型中对噬菌体鸡尾酒PP1131与环丙沙星之间的协同作用进行研究，噬菌体与抗生素联合应用在24 h后成功抑制了噬菌体抗性菌株的产生。Lopes等[40]同样证明了噬菌体ELY-1与环丙沙星联合应用可有效降低细菌密度，并防止抗性菌株的出现，甚至抗生素还能够重新使细菌对噬菌体敏感[43]。噬菌体与抗生素联合应用不太可能因为细菌产生抗性而导致失败，对噬菌体产生抗性的菌株仍然可被抗生素清除。

2 噬菌体协同抗生素

2.1 降低抗生素耐药性

噬菌体和抗生素联合应用时，以药物外排泵（efflux pumps）为受体的噬菌体迫使耐药细菌的外排泵突变以产生噬菌体抗性，导致对抗生素的敏感性增加[44-45]，这种现象被称作“进化权衡”（genetic trade-offs），当细菌在一种性状上改变以提高适应性时，往往会在另一种性状上表现出适应性下降[21]。临床研究报告表明，一例被多重耐药鲍曼不动杆菌感染的患者，通过筛选噬菌体与米诺环素联合治疗得到治愈[10]。肠球菌多糖抗原（enterococcal polysaccharide antigen， EPA）是粪肠球菌的噬菌体受体，与噬菌体的吸附相关，耐万古霉素粪肠球菌的EPA突变株对噬菌体耐药，但重新对万古霉素敏感[46]。Chan等[44]发现，噬菌体能够利用MexAB和MexXY多药外排系统的外膜蛋白OprM作为受体结合位点，对多种药物耐受的铜绿假单胞菌为阻止噬菌体入侵，改变其外排泵蛋白结构，导致其对几种抗生素的敏感性增加。大肠埃希菌的TolC蛋白是细菌外排系统的一部分，也是噬菌体进入细胞的受体，TolC改变的抗性突变体对噬菌体耐受，但对新霉素高度敏感[47]。这些现象都与噬菌体突变耐药细菌的药物外排泵有关。药物外排泵可主动将抗生素从细菌细胞内泵出，当细菌外排抗生素时，噬菌体将药物外排泵蛋白作为受体与之结合，吸附细菌并注入自身核酸。在噬菌体的选择压力作用下，部分药物外排泵发生突变，减少噬菌体吸附，此时药物外排泵无法排出抗生素，噬菌体和抗生素协同发挥作用，抑制和杀灭细菌。

此外，细菌荚膜对噬菌体的吸附十分重要，细菌极容易通过丢失荚膜来改变噬菌体吸附效率，导致抗生素对耐药细菌重新敏感[10，48-49]。Schooley团队发现多重耐药鲍曼不动杆菌可丢失荚膜对噬菌体产生抗性，但这使得抗生素更容易穿透其外膜[10]。Altamirano等[48]表明对噬菌体产生抗性的鲍曼不动杆菌合成荚膜的基因缺失，破坏噬菌体吸附，但重新对抗生素敏感。

2.2 降解生物膜

生物膜是在生物或非生物表面上形成的被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。这些胞外大分子物质是细菌群体自身产生的，主要由多糖、蛋白质、核酸和脂质构成，充当细菌群体的外部消化系统，被称作胞外聚合物（extracellular polymeric substances， EPS）[50]。生物膜的形成有助于细菌逃避宿主的免疫系统并增加其抗生素耐受性，与多种细菌的严重感染密切相关[6]。

成熟的生物膜阻止抗生素渗透到膜内部，但噬菌体可以在生物膜中形成通道，使抗生素通过该路径扩散至生物膜内部并达到较高浓度[51]。噬菌体和万古霉素结合使用能降解87%生物膜量，且耐万古霉素肠球菌的数量降低至无法检测的水平[52]。与头孢噻肟治疗组相比，T4噬菌体和头孢噻肟的组合显著增强清除细菌生物膜的效率，降低了最小生物膜根除浓度（the minimum biofilm eradication concentration）[53]。噬菌体存在时，仅使用1/2 MIC环丙沙星即观察到90%的生物膜减少，且能显著杀灭生物膜内细菌[54]。

有趣的是，经噬菌体处理后使用抗生素，又称作序贯治疗（sequential treatment），对根除生物膜的效果更佳[55-58]，这种现象的原因可能是某些抗生素能够干扰噬菌体复制[59]。有研究表明，较高浓度的抗生素会杀死生物膜表层的细菌，噬菌体吸附至死亡的细菌后无法增殖，从而降低噬菌体的滲透和扩散速率，产生较低的噬菌体暴发量[60]。另一种观点表明，抗生素存在时可明显降低噬菌体滴度，噬菌体颗粒主要由蛋白质组成，某些DNA或蛋白质合成抑制剂类抗生素可能会影响噬菌体子代的形成，对噬菌体复制有拮抗作用[61]。因此，采用序贯治疗的方法处理生物膜时能够表现出更明显的协同作用。部分噬菌体为更加有效的穿透EPS层，会在尾部或尾纤维上携带一种EPS多糖解聚酶[62]。这类酶能降解生物膜，与抗生素产生协同作用，有些还能杀灭生物膜内细菌[38，63-65]。研究表明，某些具有解聚酶活性的噬菌体在吸附、侵袭和破坏细菌生物膜方面表现得更出色[66]。

3 噬菌体与抗生素联合的临床应用

3.1 案例报告

“同情使用”（compassionate use）是一种尝试性治疗方法，用于没有其他治疗方法的危重患者，这一方法仅适用于已进入临床研究期并取得一定疗效的非注册药物，如噬菌体疗法等。在现有的噬菌体同情应用报道中，几乎都是噬菌体与抗生素联合应用[67]。但是关于噬菌体与抗生素协同作用的探讨相对较少，而将所取得的疗效都归功于噬菌体。但也有少数研究报道强调了噬菌体与抗生素的协同作用（见表1）[10，68-71] ，为今后噬菌体的临床广泛应用提供一定的参考。

2020年Tkhilaishvili团队[68]报道了1例多重耐药铜绿假单胞菌引起的假体关节周围感染。在抗生素和手术治疗均失败的情况下，患者接受噬菌体辅助治疗。噬菌体与抗生素联合治疗可有效消除感染，仅在治疗后的第三天，引流液中并未分离到铜绿假单胞菌。报道强调了噬菌体的抗生物膜活性，并且与抗生素合用时生物膜生物量的减少幅度最大。

2021年Tkhilaishvili团队[69]再次报道了1例噬菌体与抗生素联合应用成功治疗左心室辅助装置（left ventricular assist device， LVAD）感染的案例。由于抗生素治疗顽固性LVAD的高风险，该团队施用噬菌体辅助抗生素进行治疗。手术前静脉施用噬菌体共3次，并局部应用噬菌体，手术清创期间再次递送噬菌体与抗生素，手术结束后并未分离出铜绿假单胞菌。整个过程中患者仅表现出轻度恶心。

2019年Nir-Paz等[70]报道一起多重耐药细菌混合感染的细菌性骨髓炎治疗。由于细菌耐药严重且患者拒绝截肢，医院决定使用噬菌体疗法，将噬菌体与抗生素联合应用。仅在短短几天内，患者伤口开始恢复，疼痛消除，且治疗期间未监测到噬菌体疗法的不良反应，噬菌体与抗生素的联合应用比单独使用任何一种治疗方式更有效。

2018年Chan等[71]报道了一个成功治疗纵隔和主动脉移植物细菌感染的案例。患者病情反复，抗生素与手术均无法彻底根除感染。作者团队将噬菌体和抗生素混合物注入纵隔瘘中，感染很快消失，此后也没有任何复发感染的迹象。先前体外试验结果表明，噬菌体OMKO1可以结合铜绿假单胞菌外排泵，使细菌对抗生素重新敏感。在这项研究中将这一噬菌体与抗生素组合用于临床治疗，效果同样显著。

2017年Schooley等[10]报道了一起噬菌体疗法，成功治愈坏死性胰腺炎和多重耐药鲍曼不动杆菌感染患者。治疗过程中将噬菌体鸡尾酒与抗生素联合应用，使患者病情得到显著改善，最终消除高度耐药的鲍曼不动杆菌感染。有趣的是，当同时施用噬菌体与抗生素时，细菌的抗生素敏感性随其噬菌体抗性出现而增加。

以上噬菌体与抗生素的联合应用在临床中均取得显著的疗效，但后续仍然需要更多的研究来对噬菌体应用的剂量、形式、治疗持续时间以及如何与抗生素联合应用进行评估，以优化临床治疗结果。

3.2 临床试验

在东欧和苏联的部分地区一直保持有噬菌体疗法的传统。佐治亚州的Eliava研究所生产了许多纯化的用于治疗细菌感染的噬菌体制剂，并进行了一系列的临床研究，评估了噬菌体制剂对葡萄球菌感染患者的治疗效果。表2中总结了噬菌体对葡萄球菌败血症、肺部感染（包括急性和慢性肺脓肿、慢性肺炎及慢性支气管炎）及全身和局部感染的结果[72-73]。在葡萄球菌败血症治疗中，仅使用噬菌体的患者有41%（n=46）完全康复，噬菌体与抗生素联合治疗有78%的患者完全康复（n=40），仅使用抗生素的对照组中有23%（n=96）的患者完全康复。在肺部感染及全身和局部感染中也观察到类似结果。治疗结果表明，噬菌体与抗生素的联用比单独使用噬菌体更加有效。尽管人们普遍接受这些临床试验的可信度，但它在一定程度上未能满足现代严格的临床试验标准。目前噬菌体与抗生素联合应用仍有许多尚未解决的问题，需要等待一个大规模、质量可控且透明化进行的临床试验来进行有效性和安全性评估。

4 展望

噬菌體疗法作为一种抗生素替代疗法（alternative therapy），近期又逐渐受到重视，但因其有一定的局限性，越来越多的学者将噬菌体与抗生素联合应用以治疗细菌感染[74]。

抗生素耐药日益严重，单独使用抗生素极有可能出现复发感染，将噬菌体与抗生素联合应用可抑制或杀灭耐药细菌，增强疗效。单独使用噬菌体疗法时，细菌易通过丢失荚膜，突变外排泵蛋白、形成生物膜等措施减少噬菌体吸附，从而对噬菌体产生抗性。通常来说，免疫系统会协同噬菌体完成对细菌的清除[7]。

但研究表明，噬菌体通常无法彻底清除体内细菌感染，在施用噬菌体后常出现噬菌体抗性菌株，但这些突变菌株通常对抗生素重新敏感[10]。此外，抗生素会增加噬菌体裂解量，帮助噬菌体裂解酶抵达细菌肽聚糖，有效清除感染。因此，噬菌体与抗生素联合应用可能是更加合理且有效的方法。

目前没有确切的研究表明该如何选用抗生素。表3已部分列出文章中所提到的噬菌体与抗生素组合，多种抗生素均可与噬菌体协同使用。其中最主要的是β-内酰胺类等干扰细胞壁合成的一类抗生素，大环内酯类、四环素类和氨基糖苷类等抑制细菌蛋白质合成的抗生素也可与噬菌体协同使用，同时也有抑制细菌核酸合成的喹诺酮类抗生素。

需要正视的是，抗生素可能会对噬菌体药效学有负面影响[75]。一是抗生素干扰细菌代谢活性，导致与宿主细菌相关的各种噬菌体生命活动也表现出较低的活性。二是抗生素直接抑制噬菌体活性，导致噬菌体对细菌的侵袭力降低。有学者使用亚剂量抗生素以期减少对噬菌体的干扰，但细菌的MIC可能与噬菌体并不相通，需要更多的研究来确定抗生素浓度对噬菌体的影响。现有的可行方法有，在进行动物试验或人类临床治疗前，对噬菌体与抗生素组合进行筛选，避免可能出现的拮抗作用。或者采用序贯治疗，将噬菌体与抗生素先后施用，比如先使用噬菌体影响细菌状态或消除生物膜，再用抗生素进行治疗，可能会取得较好效果。

噬菌体的剂量、给药方式和持续时间同样是需要进一步探究的问题。噬菌体免疫原性可能会导致噬菌体被机体迅速清除[9]，虽然噬菌体可在体内或感染部位自行增殖，但仍需要一定的初始剂量以对抗中和抗体与巨噬细胞的吞噬作用。噬菌体的清除主要集中于肝脏和脾脏[76]，因此，局部应用、口服和注射噬菌体等不同给药方式可能出现完全不同的治疗效果。特别是在与抗生素联合应用的情况下，噬菌体的药动学和药效学更是难以预测。

目前噬菌体与抗生素联合应用的协同作用机制尚不完全明确，且多数试验研究均是在体外和动物上进行，很少有文献报道人类案例的治疗。本文在总结抗生素与噬菌体联合应用机制的基础上，简要介绍了人类临床案例，强调了噬菌体与抗生素联合应用的有效性及可能性，为人类临床中噬菌体与抗生素的联合应用提供了一定参考。噬菌体与抗生素联合应用拥有巨大前景，但仍需要谨慎地进行联合应用治疗，以防止可能出现的拮抗作用并优化治疗结果。

参 考 文 献

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收稿日期：2021-03-01

作者簡介：邵健健，男，生于1997年，在读硕士研究生，主要研究方向为兽医生物技术和中兽医学，E-mail： qxiaoy@email.swu.edu.cn

*通讯作者，E-mail： mayue6399@126.com