伊短菌素A标品的制备及HPLC定量分析

张翠央?杜杰?陈武?龙青山?唐滢?黄军?雷平?郭照辉?刘清术

摘要：目的 制備伊短菌素A标品并建立其定量分析方法。方法 发酵液经过预处理后，采用阳离子吸附树脂富集和反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化，制备得到伊短菌素A。通过质谱、核磁共振谱等确证化学结构，高效液相色谱法测定样品纯度。定量分析方法采用XAqua C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）色谱柱，流动相：0.1% TFA水溶液-甲醇（90：10，V/V）；流速：1 mL/min，检测波长：272 nm，柱温：35℃，进样量：20 μL。结果 制备了高纯度的伊短菌素A标品。优化定量条件下伊短菌素A在15～1200 mg/L范围内浓度与峰面积线性关系良好；加标回收率在92.61%～107.33%；测定峰面积的相对标准偏差为0.163566%（n=6），<1.0%；检测限和定量限分别为16.74 ng和55.79 ng。结论 本文所建立的制备方法操作简单，易放大生产。定量方法简单快速，准确度和重现性良好。适用于伊短菌素A的定量分析。

关键词：伊短菌素A；短短芽胞杆菌；高效液相分析法

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Preparation of edeine A standard and its quantitative determination by HPLC

Zhang Cui-yang1，2， Du Jie1，2， Chen Wu3， Long Qing-shan1，2， Tang Ying1，2， Huang Jun1，2， Lei Ping1，2，

Guo Zhao-hui1，2， and Liu Qing-shu1，2

（1 Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009; 2 Hunan Province Engineering Research Center for Agricultural Microbiology Application， Changsha 410009; 3 College of Plant Protection Hunan Agricultural University， Changsha 410125）

Abstract Objective To prepare the reference substance of edeine A and establish its quantitative analysis method. Methods After the fermentation broth was pretreated， edeine A was enriched by cationic adsorbent resin and separated and purified by reversed-phase high performance liquid chromatography（RP-HPLC）. The chemical structure was confirmed by MS and NMR， and the purity of the sample was determined by HPLC. The quantitative analysis was performed on an Agilent Zorbax Eclipse C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） with mobile phase consisting of 0.1% TFA and methanol （90：10， V/V）. The flow rate was 1 mL/min， the detection wavelength was set at 272 nm， the column temperature was 35℃， and the injection volume was 20 μL. Results The high-purity edine A was prepared. Under the optimized conditions， there was good linear relationship between the concentration and the peak area of edeine A in the range of 15～1200 mg/L. The average recoveries at three levels ranged from 92.61% to 107.33%. The relative standard deviations （RSDs） of peak area was 0.163566% （n=6）， < 1.0%. The limit of detection and the limit of quantification of edeine A were 16.74 ng and 55.79 ng respectively. Conclusion  The method is simple and easy to scale up. The results of the experiments have demonstrated that the established method is rapid and simple with good accuracy and reproducibility. The method is suitable for the quantitative analysis of edeine A.

Key words Edeine A; Brevibacillus brevis; High performance liquid analysis

伊短菌素（edeine）是由短短芽胞杆菌（Brevibacillus brevis）产生的多组分肽类抗生素，1959年edeine从Br. brevis Vm4中被发现[1]。Edeine是一种广谱的抗生素，对细菌、真菌、支原体和肿瘤细胞均具有抑制活性，还具有免疫调节活性[2-4]，且活性较稳定[5]。Edeine A是edeine其中一种活性组分，包括活性异构体A1和非活性异构体A2[6]。Edeine A通过非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases， NRPS）途径合成[7]，分子内含有5个氨基酸残基和1个多胺结构。研究显示edeine A的抗菌作用方式为浓度依赖型。低浓度时（<15 mg/L）可逆性地抑制DNA聚合酶II和III从而抑制DNA合成，但不影响蛋白质的合成，表现为抑菌活性[8]；在高浓度（>150 mg/L）时，edeine与fMet-tRNA竞争核糖体小亚基上的P位点，抑制蛋白质起始翻译，进而抑制蛋白合成，表现为杀菌活性[9-11]。基于此机理，edeine已经被广泛作为转录抑制剂用于研究核糖体功能和蛋白合成[12]。

次级代谢产物的含量对研究代谢产物的性质以及微生物的生物学和生化特性至关重要。Edeine A在农业生产和医药领域具有潜在的应用前景，但其在野生菌株中产量较低，难以提纯分离。本课题组从植物根际分离到一株产edeine A的生防菌株B. brevis X23，目前已经鉴定并克隆了其生物合成基因簇，并通过对基因簇的遗传改造以及培养基优化，大幅提高了edeine A的产量[13-15]，但由于目前市场上没有商品化的edeine A标准品，只能确定提高倍数，无法对工程菌的产量进行精确定量。Johnson等[16]采用LC-UV-LTQ-MS对B. fortis NRS-1210内的抗真菌活性成分进行分析，利用edeine结构类似物-酪胺在272 nm处的信号作为响应曲线，用于预估edeine的含量，显然这种方法具有一定的局限性。这不仅限制了edeine的藥理药效学研究，也限制了其在农业和医药领域的开发。本论文基于edeine A的分子结构特性，建立了简单有效的分离纯化方法，获得了高纯度的edeine A，并验证了简单高效的HPLC定量分析方法，为edeine A的产量进一步提升及产品开发奠定了基础。

1 实验材料

1.1 主要实验仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），Waters制备型高效液相色谱仪（美国Waters公司），Eclipse XDB- C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；Agilent），色谱柱XAqua C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm，华谱新创科技有限公司）；核磁共振仪（600MHz，Bruker BioSpin公司）；高通量Q-TOF液质联用仪（美国Agilent公司）；Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）；IKA旋转蒸发仪（德国IKA公司），电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 实验试剂

甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）；乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；三氟乙酸（TFA，色谱纯，美国TEDIA公司）；甲酸（色谱纯，天津科密欧化学试剂公司）；Milli.Q水。

1.3 实验菌株

短短芽胞杆菌X23（Br. brevis X23）菌株为湖南省农业大学植保学院分离并保存。

2 实验方法

2.1 Edeine A样品的制备

Edeine A的分离纯化参考Westman等[6]报道的方法进行，并做了部分修改和优化。短短芽胞杆菌X23菌株斜面培养成熟后，接种于种子培养基，置于28℃、180 r/min摇床，培养24 h；种子液再转接入30 L发酵罐，采用GNB液体培养基（葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，去离子水1000 mL）培养，接种量为10 %，28℃、180 r/min，培养48 h。发酵液在发酵罐内直接经预处理后排出，过滤除去菌体和杂蛋白，参考文献方法[17]，用Workbeads 100S阳离子交换树脂富集后，用稀碱水洗脱，收集洗脱液，浓缩至10 mL。样品过滤后经UPLC液相制备（XBridge Pre C18（19 mm×150 mm， 5 μm）；甲醇-0.1%TFA水溶液梯度洗脱（0～10 min，2%～10%甲醇），流速10 mL/min，检测波长272 nm）。粗品经Agilent HPLC色谱制备（Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm），甲醇-0.1%TFA水溶液梯度洗脱（0～20 min，0～10%甲醇）；流速1.0 mL/min，检测波长272 nm）纯化后得白色粉末，具有强吸湿性，冻干后密闭低温保存。

2.2 Edeine A的HPLC定量分析

2.2.1 色谱条件考察

对edeine A的HPLC色谱条件进行考察，主要包括其最大吸收波长，适宜的流动相、流速、色谱柱以及柱温。根据考察结果确定HPLC定量分析条件。

2.2.2 样品溶液的配制

精密称定样品30 mg，用纯水溶解，定容至10 mL，制成30 mg/mL的edeine A贮备液。

分别精密量取edeine A贮备液 5、50、100、200、300和400 μL、于1 mL容量瓶中，水定容至刻度，振摇均匀，即为浓度为15、150、300、600、900和1200 mg/L的系列样品溶液。

2.2.3 标准曲线的绘制

精密量取不同浓度的edeine A系列样品溶液20 μL，分别注入液相色谱仪，记录各浓度对应的峰面积值，以峰面积（Y，mAU×S）对浓度（X，mg/L）进行线性回归。

2.2.4 精密度及加标回收率测定

取“2.2.2”项下浓度为300 mg/L edeine A样品溶液，连续重复注入液相色谱仪6次，每次精密量取20 μL，计算峰面积的RSD。要求6份溶液含量的RSD≤3%，来证实方法具有良好的精密度。

精密移取2份相同体积（1.00 mL）edeine A樣品溶液（300 mg/L），分别加入0.50和0.20 mL水稀释，即得200和250 mg/L edeine A样品溶液。分别精密移取300、250和200 mg/L edeine A样品溶液各1.00 mL，置于3支盛有相同体积（1.00 mL）edeine A供试品溶液（按标曲计算280.4 mg/L）的试管中，混合均匀，得到3种不同浓度的edeine A加标试样溶液。对每个浓度的edeine A溶液均平行进样6次，每次精密量取20 μL溶液注入液相色谱仪，记录峰面积值。要求回收率在80.0%～120.0%之间，以证实该方法具有良好的准确度。

3 结果与分析

3.1 Edeine A样品的制备及结构验证

由于缺乏商业化的edeine A标准品，为建立其定量分析方法，首先要制备edeine A的样品。通过优化方法，将短短芽胞杆菌X23发酵液经过阳离子交换以及两步HPLC分离纯化后，制备得到edeine A样品，其在HPLC上呈现单一峰。经HPLC-DAD峰面积归一化法分析，纯度为99.83%。

为确保分离制备的样品的准确性，采用ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR等手段对制备得到的edeine A样品进行结构验证，edeine A的分子结构见图1，结构表征见图2。用高分辨质谱进行分析得到m/z为755.4433[M+H]+，质谱碎片592.3785、505.3461、419.2984、203.1870和147.0443均与edeine A碎片一致。经过数据库比对得到该结构为C33H58N10O10，与edeine A的分子式一致。1H NMR、13C NMR结果显示， 1H NMR（600 MHz CDC13）：1.50 （2H， m， Spe-H-6）， 1.68 （2H， m， Spe-H-5）， 1.79 （6H， m， A2ha-CH2-， Spe-H-2， H-3）， 1.91 （2H， t， J=7.2 Hz， Spe-H-7）， 2.55 （2H， m， A2ha-CH2-）， 1.99， 2.89 （2H， dd， J1=5.4 Hz， J2=15.6Hz， A2ha-CH2-）， 2.90 （1H， m， A2ha-C（-NH2）H-）， 3.04 （2H， m， Tyr-CH2-CO-）， 3.05 （2H， m， Spe-H-4）， 3.06 （2H， m， ）， 3.26， 3.47 （1H， m， A2pr-CH-）， 3.35 （1H， m， A2ha-C（-OH）H-）， 3.38 （2H， m， Spe-H-1）， 3.58 （2H， t， J=3.6Hz， Ise-CH2-）， 3.90 （2H， q， J1=J3=4.8Hz， J2=21Hz， A2ha-CH2-CO-）， 4.00 （1H， dd， J=4.8， 9.6Hz， Ise-CH-）， 4.13 （2H， m， A2pr-CH2-）， 4.32 （1H， m， A2ha-CH-）， 4.43 （1H， m， Gly-CH2-）， 4.63 （1H， m， Tyr-CH-）， 6.80 （2H， d， J=8.4Hz， Tyr-Ph-H）， 7.30 （2H， d， J=8.4 Hz， Tyr-Ph-H）。综上， ESI-MS、1H NMR（600 MHz， CDC13）、13C-NMR（600 MHz， CDCl3）和COSY结果，以上数据与文献报道一致[6]，故鉴定为edeine A。

3.2 Edeine A样品的HPLC定量方法

3.2.1 最大吸收波长的确定

将edeine A样品在190～360 nm波长范围内采用紫外扫描，发现将272 nm作为检测波长时，edeine A有特征吸收峰，且无其他杂质干扰，见图3。因此，选定272 nm作为HPLC定量分析的检测波长。

3.2.2 流动相和流速的选择

为了确保edeine A及其杂质可以分开，分别选择不同比例和不同pH值的甲醇+水、甲醇+0.1%TFA水溶液、甲醇+0.1%甲酸水溶液、乙腈+水、乙腈+0.1%TFA水溶液、乙腈+0.1%甲酸水溶液等作为流动相，对待测样进行分离检测。洗脱条件为0～5 min，10%有机相等度洗脱；5～10 min，10%～100%有机相梯度洗脱。结果表明，当流动相为甲醇：0.1%TFA水溶液=10：90 （V/V）等度洗脱时，edeine A在5 min内出峰，且其他水溶性组分均能得到理想的分离且基线平稳。因此，选择甲醇：0.1%TFA水溶液=10：90 （V/V）作为流动相。在流速0.8、1.0和1.2 mL/min下进行考察，流动相在流速1.0 mL/min的条件下，分离度和对称性均较好，且柱压低，安全性好（图4）。

3.2.3 色谱柱的选择

取适量供试品溶液，在检测波长272 nm、流动相：甲醇：0.1%TFA水溶液=10：90 （V/V）、体积流量1.0 mL/min、进样量20 μL色谱条件下，采用Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）、XAqua C18（4.6 mm×250 mm， 5μm）色谱柱进行考察，结果表明，运用XAqua C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）色谱柱分析edeine A时，tR从3.27min延长到7.95min，大大增加了其在柱内的保留时长及其与杂质之间的分离效果（图5）。

3.2.4 柱溫的选择

对供试品溶液在不同柱温25℃、30℃和35℃下进行考察，当柱温为35℃时，基线稳定，对称性较好。

3.2.5 优化获得的色谱条件

色谱柱XAqua C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相：甲醇：0.1%TFA水溶液=10：90 （V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：272 nm；柱温：35℃；进样量：20 μL。

3.3 方法验证

3.3.1 标准曲线的绘制

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线（图6），计算线性回归方程及相关系数。Edeine A的线性方程为：y=1.0763×C-44.664（r2=0.9962），edeine A在15～1200 mg/L范围内线性关系良好。

3.3.2 精密度实验

精密度实验用于检验方法的重复性是否良好。如表1所示，以300 mg/L的样品溶液为例，连续重复进样6次，所测定的edeine A峰面积的RSD为0.163566%，再现性良好。在两台不同的仪器下测试，峰面积数值仍然具有良好的重复性。

3.3.3 加标回收率测定

加标回收率的测定，是实验室内经常用以自控的一种质量控制技术。加标回收率计算公式为：

P= ×100%

式中：P为加标回收率；C0为加标用标品溶液浓度；C1为试样浓度；C2为加标后试样浓度；V0为加标体积；V1为试样体积；V2为加标后试样体积，V2=V1+V0。C1和C2均由将峰面积代入标准工作曲线中的线性回归方程计算得来。

在供试品溶液中添加80％、100％和120％的edeine A样品（200、250和300 mg/L），进样20 μL，峰面积值代入到线性公式得出加标后试样浓度。根据加标回收率公式计算，回收率均在92.61%～107.33%范围内，说明准确度良好（表2）。

3.3.4 检测限和定量限

取“2.2.2”项下浓度为300 mg/L样品溶液适量，用水逐级稀释成低浓度，吸取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以仪器噪音的3倍峰高作为检测限，进样量为20 μL测得edeine A样品的检测限为16.74 ng。以仪器噪音的10倍峰高作为定量限，进样量为20 μL测得edeine A样品的定量限为55.79 ng。

采用优化的高效液相色谱方法进行edeine A样品的定量实验，方法验证结果表明，该方法的准确度和精确性均良好，且具有较好的重复性。所制备的样品可以作为标准品用于edeine A的定量分析。

4 结论与讨论

本试验通过离心过滤、离子树脂富集以及反相色谱等技术，对短短芽胞杆菌X23（Br. brevis X23）发酵液中的水溶性部分进行分离纯化，制备的edeine A为白色粉末，极易吸潮，易溶于水，通过HPLC归一化法测定和ESI-MS、NMR等手段确认edeine A的化学结构。通过高效液相色谱法对edeine A进行定量分析，考察了不同的色谱柱、流速、流动相和温度对定量过程的影响，优化后的定量方法精确性、准确度均良好。实验结果表明本文所述方法制备的样品可以作为标准品用于edeine A的定量分析。

本试验制备edeine A的技术路线简单可行，避免了有机试剂提取等操作，绿色环保，所需设备简单易得，易于在发酵车间放大，制备的edeine A纯度高，性质稳定。edeine A结构内含有多个极性基团，分子极性较大，通常该类物质在常规C18色谱柱上具有极弱的色谱保留能力，常与水溶性杂质在死时间内同时出峰，分离度小而无法准确定量。以往报道的文献中，类似物质的定量往往对样品进行预处理后，针对不同物质的性质，采用不同的方法进行测量。如Zhao等[18]将样品用HCl水解成氨基酸后，以标准氨基酸混合溶液为外标，采用气质联用仪测量游离氨基酸的浓度，以此来计算活性代谢物surfactin（表面活性肽）的含量。Masakazu等[19]对产生gramicidin（短杆菌肽，线性十肽）的Bacillus brevis （ATCC 8185）菌体用乙醇进行提取后，经过两次氧化铝柱进行提纯，柱层析产物重氮化反应后，采用分光光度计测量660 nm波长处的吸收，用于计算gramicidin的含量。Sarma等[20]运用高效液相法对药物制剂中的gramicidin的含量进行了测定，gramicidin的保留时间在2.49 min，并进行了方法学验证。但文献中未涉及样品的处理及反相柱填料的性质等关键信息。

采用本实验优化的方法，省略了复杂的样品前处理操作，减少样品中的损失。选择的反相极性XAqua C18柱对edeine A的吸附能力较好，分析过程中延长了edeine A保留时间，提高了目标峰的分离度，经过优化后的HPLC方法可简单快速地对发酵液中的edeine A进行定量分析。标准品的获得以及定量分析方法的建立，为edeine A产量的提高以及相关产品开发奠定了坚实的基础，也为类似性质化合物的定量分析提供了思路。

参 考 文 献

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收稿日期：2021-07-28

基金项目：国家自然科学基金项目（No. 31772216和No. 32000047）；湖南省自然科学基金项目（No. 2019JJ40169和No. 2019JJ40119）

作者简介：张翠央，女，生于1988年，硕士，助理研究员，研究方向为微生物次生代谢产物开发与利用研究，E-mail： zhang_cuiyang@163.com

*通讯作者，E-mail： volcanoya@126.com