X连锁隐性点状软骨发育不良胎儿超声影像与基因变异分析

朱海燕,陈媛媛,牛艳艳,张云山,吴 迪,姜 琳

(中国人民解放军总医院第六医学中心 a.妇产科;b.超声医学科，北京 100048)

X连锁隐性点状软骨发育不良(chondrodysplasia punctata 1,X-linked recessive,CDPX1,OMIM:302950)，是一种相对罕见的以骨矿化异常为特征的先天性骨和软骨发育缺陷，活产婴儿发病率为1/100000，具有高度的临床异质性和遗传异质性[1]。CDPX1主要临床表现包括：(1)软骨内骨形成区的点状钙化，婴儿期X线检查可观察到骨骼具有特征性的骨骺点状钙化斑点(点状骨骺)，斑点可在2～3岁间消失；(2)严重的面中部发育不良，鼻梁缺失或发育不全，导致鼻基部平坦，鼻尖突出减少；(3)远端指(趾)骨短缩；(4)身材矮小；(5)部分患者可合并传导与感音混合性听力下降。骨骼异常在成年期有所改善，但部分患者因严重的鼻颌发育不良、气管和支气管软骨内广泛钙化所致的上下气道狭窄可导致呼吸异常，或伴有颈椎狭窄、不稳定，采取对症治疗可部分缓解病情，绝大多数患者寿命正常。

门诊就诊的患儿，其面部特征或呼吸问题显而易见，但妊娠期胎儿的面容或呼吸在产前超声检查过程中不易发现，因此关于CDPX1的产前诊断报道较少。本研究结合产前超声检查发现的胎儿面中部发育异常，应用基于新一代高通量测序(next generation sequencing,NGS)技术的基因组拷贝数变异测序(copy number variation sequencing,CNV-seq)及全外显子组测序(whole-exome sequencing,WES)技术，对胎儿进行全面遗传学分析及研究，最终为胎儿明确诊断为CDPX1，为该家系再生育提供遗传咨询，为产前超声诊断及临床咨询提供实践经验。

1 材料与方法

1.1 材料 孕妇(I:1)，35岁，G2P1，第一胎(II:1，与前夫生育)男性健康，见家系图(图1A)。外省医院建档产检，胎儿(II:2)12周超声CRL 5.8cm，NT 1.2mm。当地医院NIPT检测提示21、18、13号染色体非整倍体低风险。22周超声：胎儿生长发育与LMP孕周相符，因鼻孔显示不清转诊我院。我院胎儿超声复查：双顶径5.81cm，头围22.67cm，腹围17.82cm，股骨长4.07cm；双侧脑室7.1mm；上唇连续；鼻尖低平，鼻额角>135°(图1B)，可见两个距离较远的鼻孔样回声(图1C)，鼻骨可见，长约1.0cm，两片鼻骨之间呈“八”字形张开(图1D)，距离约1cm；眶间距比：3.90/1.74=2.2；左心室强回声光点，约3mm。提示：孕周23+5周；胎儿鼻形态异常，眼间距增宽。孕妇妊娠期间无患病及用药史。夫妻双方表型均正常，非近亲，无不良家族史。夫妻要求产前诊断，寻找病因，后于妊娠26周要求终止妊娠。本研究经医院伦理委员会批准(HZKY-PJ-2020-48)。

1.2 方法

1.2.1 胎儿标本取样 夫妻签署知情同意书后，进行羊膜腔穿刺，采集羊水30mL。

1.2.2 染色体核型分析 20mL羊水分两线常规培养，G显带，染色体核型分析。

1.2.3 基因组DNA制备 采用血液/组织基因组DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini kit,Qiagen,Germany)，提取夫妻外周静脉血及羊水细胞的基因组DNA。

1.2.4 CNV-seq检测及分析 根据专家共识[2]，对超声检查发现结构异常的胎儿进行染色体拷贝数变异分析，了解其微缺失/重复变异。取胎儿羊水细胞基因组DNA，按操作流程构建文库，质控合格后于NextSeq CN500基因测序仪上机测序，测得数据使用专用软件分析，判断对应染色体检测区域的拷贝数(单倍体、二倍体、多倍体)或嵌合等。

1.2.5 WES检测及数据分析 委托第三方检测公司进行，取胎儿基因组DNA，打断法构建文库，定量后，与全外显子组捕获探针(Nano WES Human Exome V1.0，Berry genomics,Beijing,China)试剂进行杂交、富集及纯化，使用高通量测序仪器(Illumina Hiseq 2500)进行双向测序。对原始数据进行测序质量评估，根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)变异的分类与标准[3-4]，对测序结果的病理学意义进行分析解读。

1.2.6 Sanger测序突变验证 依据WES检测分析结果，针对ARSE(NM_000047.2)基因11外显子，采用Primer3软件(Primer3webversion4.1.0，http://bioinfo.ut.ee/primer3/)设计引物，F5'-TGAAGATGCCATTCTCCAGC-3'，R5'-CCAGCTGGTTTGTTTCAATTTGA-3'。对胎儿及夫妻进行该位点PCR扩增，产物回收纯化后经Genetic Analyzer 3500dx型测序仪(ABI，美国)毛细管电泳测序，与标准序列进行比对。

1.2.7 引产胎儿观察 胎儿眼距明显增宽，面部扁平，面中部发育不良，整个鼻部似塌陷于面中部，几乎没有鼻部隆起，鼻翼宽，鼻头扁(内陷)，鼻孔未张开。脊柱、四肢及外生殖器(男性)等未见异常。

2 结 果

2.1 核型分析 胎儿羊水细胞染色体数目及结构未见异常。

2.2 CNV-seq分析 胎儿检测显示seq[hg19]del(5)(p15.32p15.31)，提示5号染色体p15.32-p15.31(chr5:g 4660001_6960000)区域杂合缺失2.3Mb(临床意义未明)。夫妻双方CNV-seq验证，提示胎儿该变异来自父亲。

2.3 WES检测 胎儿WES数据分析显示，ARSE基因NM_000047.2:c.1743G>A;p.(Trp581X)半合子变异。该变异导致第581位色氨酸(TGG)密码子突变为终止密码子，翻译终止。人类基因突变数据库(human gene mutation database,HGMD)有收录[5]，为致病变异。分析胎儿5pp15.32-p15.31杂合缺失区域内NSUN2基因的测序数据，未见该基因序列变异。

2.4 Sanger测序验证 胎儿ARSE基因c.1743G>A半合子变异，孕妇该位点为杂合变异，丈夫为野生型(图2)。

3 讨 论

点状软骨发育不良(chondrodysplasia punctata，CDP)是较为罕见的骨骼发育异常综合征，病因复杂，根据不同致病基因及遗传方式，CDP分为多种类型。其中，X连锁隐性遗传的CDPX1，表现为严重的鼻颌发育不全、点状软骨发育不全、身材矮小和远端指骨缩短。致病基因ARSE位于X染色体短臂(Xp22.33)，靠近拟常染色体区域，其最后一个外显子(外显子11)是最大的一个外显子，而且是编码蛋白的关键区域。在CDPX1患者中，ARSE基因的变异类型[1]涉及单个或多个外显子的缺失、整个基因的缺失、错义突变、单个碱基的插入或缺失突变等，但不同类型变异的基因型与表型严重程度之间没有明确相关性。

本研究中胎儿在妊娠中期超声显示面中部发育不良，上颌角增大，未见胎儿典型的饱满的面部、鼻部的隆起及鼻孔回声。羊水细胞核型分析未见染色体数目及结构异常，CNV-seq检测显示胎儿5p15.32-p15.31区域2.3Mb杂合缺失(临床意义不明)，该变异来自表型正常的父亲。该区域包含NSUN2基因[OMIM:610916]的全部，该基因突变与常染色体隐性遗传的智力发育迟缓5型(mental retardation-5,MRT5，[OMIM:611091])相关，主要表现为产后生长发育迟缓，中度至重度智力障碍，神经运动发育迟缓，特殊面容(鼻翼发育不全)，构音障碍，反射亢进等。虽然超声影像显示胎儿鼻发育异常表型与MRT5特殊面容相关，但后续的WES未检测到NSUN2基因存在其他序列变异，经查询DGV、DECIPHER、UCSC公共数据库资源，未见NSUN2基因缺失导致MRT5的病例报道。因而，根据MRT5的遗传方式，认为该微缺失变异与胎儿鼻发育异常无明显相关，因而排除该杂合缺失的致病可能性。同时WES检测发现胎儿ARSE基因的半合子变异，遗传自母亲，胎儿的表型与该基因变异导致的CDPX1相符，引产后胎儿面部及鼻部的发育异常较超声观察更为明确。本研究胎儿的c.1743G>A (p.Trp581X)变异，位于基因的最后一个外显子，虽然靠近基因的末端，但仍位于编码蛋白的关键功能区域内。该变异最早于1998年报道[5]，在一个家系的多个患者存在该变异。另有研究[6]报道，16例患者中12例检测到ARSE基因变异，4例为c.1743G>A，均明确了该变异的致病性。本研究中，母亲拒绝为其健康的儿子进行基因检测，而且家系中没有其他患者，未能在家系内完成表型与基因型共分离的检测，但通过胎儿的表型与基因型分析，结合该变异位点已有的相关致病性研究，综合分析为胎儿明确诊断为CDPX1。

多数患有CDPX1的胎儿，在妊娠期通常缺少显著的主要脏器结构异常，产前诊断较难发现。有研究[7]报道，1例新生儿出生后发现鼻发育不良、呼吸困难、四肢短，X线检查发现典型的点状钙化灶，基因检测提示ARSE基因c.1219G>A半合子变异，诊断为CDPX1。有报道[8]对产前超声发现长骨发育落后但未见面部及鼻骨发育异常的胎儿直接进行WES检测，发现ARSE基因的新错义突变c.265A>G(p.Ser89Gly)，并通过多种功能实验(RT-qPCR、Western blot及ARSE酶学分析)证实该错义突变的致病性，证实为CDPX1。本研究中胎儿仅表现为严重的面中部发育不良，鼻部塌陷，超声未发现脊柱、长骨的异常钙化影像，与这些报道病例的表型略有不同。由于家人要求尽快处理引产胎儿，未进行X线检测。该病例的影像学和分子遗传学分析研究，为产前诊断工作中发现胎儿面部发育异常的病例积累了经验。在胎儿超声筛查中，观察到胎儿眶间距增宽、面部平(鼻颌角增大)、鼻骨发育不良等异常时，建议关注主要脏器结构的同时还应注意观察胎儿脊柱、四肢等骨骼钙化及发育情况。在进一步的产前遗传检测分析工作中，在常规核型分析及CNV-seq检测的同时，还要考虑到相关的单基因病。

伴随NGS技术的快速发展和应用推广，基因组或外显子组测序在产前诊断中越来越体现出其技术优势，在产前超声筛查发现异常但染色体分析未见异常而进行的WES研究显示，基因致病变异的整体检出率为10%，而在存在超过2个以上的结构异常的胎儿中，基因致病变异的检出率达19%[9]。美国医学遗传学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)建议[10]，当存在一个或多个显著异常的胎儿无法使用常规产前方法获得诊断时，可考虑WES，有利于及时判断相应的疾病和可能的预后，有助于临床进一步诊断和治疗的选择。