孕晚期孕妇血管内皮钙黏蛋白水平和IgG抗A/B抗体效价对ABO型胎儿新生儿溶血病的产前诊断价值*

姜丹丹，丁建娥，邵淑玲，丁金钰，董秀梅，刘 鹏

(青岛市黄岛区人民医院，青岛 266400)

胎儿新生儿溶血病(haemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN)一般指胎母血型不合引起的胎儿或新生儿同种免疫性溶血性疾病，临床表现有胎儿水肿、早期流产或死胎，新生儿黄疸、贫血、肝脾肿大等，严重者可出现核黄疸，甚至死亡[1]。在我国以ABO血型不合HDFN(ABO-HDFN)发病率高，重症者时有报道，因此有必要在产前规律监测母体IgG抗A/B抗体水平，但目前临床对新生儿溶血严重程度与孕妇血清抗体效价间的相关性存在意见差异[2]。已有研究通过测定血管内皮微粒体(endothelial microparticles，EMPs)证实，ABO-HDFN患儿的血管内皮受到损伤，且EMPs水平与疾病严重程度呈正相关[3]。由此，笔者思考患儿在宫内发病时，能否通过胎盘等影响母体外周血中血管内皮损伤标志物[如血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-Cad)]的浓度。本研究通过检测孕晚期母体外周血VE-Cad水平及IgG抗A/B抗体效价，对其与ABO-HDFN的发生发展进行相关性分析，以期为产前诊断和早期防治ABO-HDFN提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年4月至2021年2月在青岛市黄岛区人民医院产检的O型Rh(D)阳性孕妇80例，不规则抗体筛查均为阴性，且孕妇与丈夫血型不同。排除标准：(1)其他血型系统新生儿溶血及其他原因导致的新生儿溶血(地中海贫血症、遗传性球形红细胞症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏等)；(2)合并感染：临床诊断为感染(包括败血症、肺炎等)或CRP>10mg/L者；(3)新生儿缺氧：胎儿宫内窘迫、围产期窒息；(4)大的头部血肿或严重挫伤；(5)母亲吸烟或慢性高血压、糖尿病、系统性红斑狼疮或其他自身免疫性疾病；(6)母亲生育过新生儿溶血病患儿等。孕妇年龄20～45(30.44±5.30)岁，A-O血型夫妻40例，B-O血型夫妻36例，AB-O血型夫妻3例。依据新生儿发生ABO-HDFN情况将孕妇分为ABO-HDFN组(n=42)与对照组(n=38)。本研究经本院伦理委员会组织审核批准，所有受试者均取得孕妇和家属同意，并自愿签署知情同意书。

1.2 实验分组依据 新生儿溶血三项试验——直抗、游离、放散试验均为阴性的孕母归为对照组；放散试验阳性，无论直抗、游离试验结果如何，均认定为ABO新生儿溶血病，其孕母归为ABO-HDFN组。

1.3 试剂与仪器 抗-A、抗-B、ABO反定红细胞、抗-D试剂、β-巯基乙醇(上海血液生物医药提供，且在有效期内使用)，人血管内皮钙黏蛋白ELISA试剂盒(江莱生物技术)，低离子抗人球蛋白卡(微柱凝胶法)(瑞士达亚美)；DIANA免疫微柱孵育器(西班牙基立福)，振荡恒温金属浴(MB-102，杭州博日科技)，医用离心机(T-24，迈克医疗电子)，医用离心机(BY-150C，北京白洋医疗器械)，全自动血型分析仪(IH1000，美国伯乐公司)，全自动生化分析仪(DA7600，日本日立)。

1.4 研究方法

1.4.1 血型血清学检测及不规则抗体筛查 将孕妇及新生儿血标本3000r/min离心5min，使用微柱凝胶卡在IH1000全自动血型分析仪上完成，稀释、加样、孵育、离心、结果判读均由仪器自动完成，操作方法严格按标准操作规程执行。

1.4.2 溶血三项试验 采集新生儿标本(外周静脉血或脐带血)，洗涤，进行溶血三项试验：直接抗人球蛋白试验、游离抗体试验与抗体释放试验。直抗试验以出现凝集为阳性，游离和放散试验均以检出可以和新生儿红细胞反应的抗体为阳性，以放散试验阳性为ABO-HDFN的确诊标准。

1.4.3 IgG抗A/B抗体效价测定 取100μL孕妇血浆加等量β-巯基乙醇，混匀，置37℃温育10min，用生理盐水倍比稀释，加与丈夫血型相同的ABO试剂红细胞，37℃孵育30min，测定相应的IgG血型抗体效价。具体操作严格按照《全国临床检验操作规程(第3版)》[4]完成。

1.4.4 血管内皮钙黏蛋白检测 采用EDTA抗凝标本离心所得孕妇血浆进行酶联免疫吸附试验，用酶标仪在450nm波长处测定OD值。所有操作均按试剂操作说明进行。

1.4.5 观察指标 收集所有受试者的年龄、妊娠史、新生儿性别、血型、体重、总胆红素(total bilirubin，TBIL)等一般资料。

2 结 果

2.1 孕妇和新生儿的临床资料 ABO-HDFN组与对照组的孕妇年龄、分娩方式、新生儿性别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 孕妇和新生儿临床资料的比较[n(%)]

2.2 ABO-HDFN组与对照组孕妇VE-Cad水平比较 与对照组相比，ABO-HDFN组孕妇的VE-Cad水平升高，差异有统计学意义[0.65(0.21～1.62) vs 2.25(1.15～5.12)ng/mL，P<0.0001]。

2.3 孕妇抗体效价与其患儿例数的分布情况 ABO-HDFN组孕妇IgG抗-A/B效价≥1∶64者41例，占97.62%；对照组≥1∶64者17例，占44.74%，效价≤1∶32者21例，占55.26%(表2)。

表2 孕妇抗体效价与其患儿例数的分布情况

2.4 VE-Cad水平、IgG抗体效价与新生儿TBIL的相关性分析 孕妇VE-Cad水平与新生儿总胆红素呈正相关(r=0.4264，P<0.05),但IgG抗体效价与新生儿总胆红素无显著相关性(r=0.0635，P=0.730)，见图1。

2.5 VE-Cad水平、IgG抗体效价对ABO-HDFN的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，VE-Cad水平的曲线下面积(AUC)为0.762，诊断界值(cut-off)取1.008ng/mL，敏感度为80.95%，特异度为63.16%；IgG抗体效价的AUC为0.862，cut-off值为1：64，敏感度为88.10%，特异度为71.05%；两者联合诊断的AUC为0.915，敏感度为92.86%，特异度为84.21%。见图2、表3。

表3 VE-Cad水平、IgG抗体效价及联合因子的AUC

3 讨 论

ABO-HDFN是指由于母婴血型不合，母体内存在着针对胎儿红细胞抗原的IgG抗体，抗体通过胎盘与胎儿体内的靶抗原结合所发生的一系列症状。研究表明，越早发现、早诊断，HDFN的治疗效果越好[5]，但ABO-HDFN的产前诊断一直是挑战产科医生和输血人员的一个难题。

患儿母亲血清IgG抗-A/B效价对预测患儿罹患HDFN有较大的预判作用，临床通常将孕妇血清抗体效价1∶64作为临界值[6]，若效价≥1∶64时，表明婴儿有发生ABO-HDFN的可能性。本研究42例ABO-HDFN组中抗体效价≥1∶64者41例(占97.62%)，符合相关文献报道[7]，但也有1例效价为≤1∶32，表明临床上不能忽视母亲抗体效价低的高胆红素血症患儿；而对照组中抗体效价≥1∶64者高达44.74%，其中2例抗体效价≥1∶512并未发生HDFN，且IgG抗-A/B效价与新生儿TBIL未见明显相关性(P>0.05)，这可能与抗体亚型、血型物质含量、胎盘作用等因素有关[8]。

ABO血型抗原是组织血型抗原，广泛存在于人体组织和器官中，并且强烈表达于内皮细胞表面。研究报道[9]，CD144+微粒体可作为ABO-HDFN患儿发生血管内皮损伤的标志物，并且患儿EMPs水平与血管功能障碍和疾病严重程度呈明显相关性。可见，母体的抗A、抗B抗体不仅与患儿红细胞表面相应抗原结合引起溶血，也可与内皮细胞表面的靶抗原结合继而引起血管内皮的损伤[10]。VE-Cad是构成血管内皮细胞间黏附连接的主要结构分子，通过与连接素和肌动蛋白细胞骨架蛋白相互作用来调节血管内皮屏障的稳定性，是血管发育和通透性调节不可缺少的物质[11]。前期研究发现，VE-Cad在ABO新生儿溶血病患儿中的水平升高[12]。本研究对孕晚期孕妇的VE-Cad水平进行检测分析，发现ABO-HDFN组孕妇的VE-Cad升高，差异有统计学意义(P<0.0001)，且孕妇VE-Cad水平与新生儿总胆红素水平呈显著正相关(r=0.4264，P<0.05)。由此推测孕晚期孕妇的VE-Cad水平可作为产前检测ABO-HDFN的指标。

本研究对孕妇VE-Cad水平、IgG抗体效价的诊断效能进行评价：VE-Cad水平对ABO-HDFN诊断的AUC为0.762，敏感度和特异度分别为80.95%和63.16%；IgG抗体效价的AUC为0.862，敏感度和特异度分别为88.10%和71.05%；两者联合诊断的AUC为0.915，敏感度为92.86%，特异度为84.21%。表明联合测定VE-Cad水平和IgG抗体效价，可提高ABO-HDFN产前诊断的敏感度，对ABO-HDFN的早期诊断具有重要意义。

在国内ABO血型不合所致的HDFN发生率较高[13]。专家推荐[14],备孕女性怀孕前或妊娠8～12周建档时进行ABO血型鉴定和IgG血型抗体，若IgG抗-A/B效价<1∶64，妊娠28周后复查，若效价没有变化可正常分娩；若IgG抗-A/B效价≥1∶64或效价升高≥2个稀释度(如首次效价为4，现上升至16)，推荐增加检测频次：1次/2周(妊娠28周至分娩)，并可检测VE-Cad水平以提高ABO-HDFN产前诊断率。

综上所述，孕晚期ABO-HDFN组孕妇的VE-Cad水平和IgG抗体效价均升高，联合检测VE-Cad水平和IgG抗-A/B抗体效价可提高诊断敏感度，且易于临床应用和操作，对于产前诊断ABO-HDFN具有重要作用。