HPLC-MS/MS 测定大鼠脑脊液中4-(4-氨基苯基)丁酸浓度

邱政辉，赵 萌，孔珊珊，范兰兰，吴鑫慧，叶晓霞,†

(1.温州医科大学药学院，浙江温州 325035；2.连云港市妇幼保健院，江苏连云港 222000)

4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）是一类内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）抑制剂，具有分子伴侣活性的小分子化合物，能够抑制蛋白质错误折叠，稳定蛋白构象[1-2].研究表明，4-PBA 可以通过抑制葡萄糖调节蛋白78（GRP78）介导的信号传导通路对脑缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion，I/R）小鼠模型的神经元起到保护作用，且可以显著改善I/R 小鼠的记忆能力[3-5].为了寻找对I/R 有更好治疗作用的药物，本文对4-PBA 进行了结构改造和初步的活性筛选.

研究发现，在ATP 缺失细胞模型中，4-PBA 类似物4-(4-氨基苯基)丁酸（4-(4-aminophenyl)butyric acid）表现出比4-PBA 更优的细胞保护作用，且保护作用也更优于脑卒中临床用药依达拉奉[6-9].为进一步在动物模型中探讨4-(4-氨基苯基)丁酸能否有效穿透血脑屏障起到治疗脑卒中的作用，本文构建了高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法以测定腹腔给药后大鼠脑脊液中4-(4-氨基苯基)丁酸的药物浓度，以期为该药物后期研究和开发提供参考.

1 仪器与材料

1.1 仪 器

高效液相色谱仪（ACQUITY 系统，美国Waters 公司）串联质谱仪（美国Waters 公司），台式高速冷冻离心机（美国Thermo Forma 公司），超低温冰箱（美国Thermo Forma 公司），MVS-1型涡旋混合器（北京北德远大科技有限公司），实验动物脑立体定位仪、眼科剪、止血钳（均产自深圳市瑞沃德生命科技有限公司）.

1.2 材 料

1.2.1 试 剂

4-(4-氨基苯基)丁酸对照品（纯度99.9%，批号BD12148，百灵威化学技术有限公司），乙腈（色谱纯，批号137738，赛默飞世尔）.

1.2.2 实验动物

50 只雄性清洁级SD 大鼠（200-250 g）购自温州医科大学实验动物中心（生产许可证编号为SCXK(浙)2020-0001，使用许可证编号为SYXK(浙)2020-0014），饲养于室温、昼夜交替的环境中，自由进食和饮水两周.本实验操作严格遵守温州医科大学实验动物管理相关规定，符合动物生产和使用规范.实验动物方案经实验动物伦理委员会批准.

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters AtlantisTM-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）.以含0.1%甲酸的水（A）和乙腈（B）进行梯度洗脱（0-1.5 min，5% B→95%B；1.5-2.5 min，90%B；2.5-3.0 min，90% B→5%B；3.0-4.0 min，5%B），流速0.4 mL/ min，柱温25℃，进样量1μL.

2.2 质谱条件

采用离子阱离子源，正电荷检测模式，检测方式为多反应检测（MRM）；毛细管电压3 kV，锥孔电压38 V，碰撞能量12 V，去溶剂化温度350℃，脱溶剂气流量650 L/ h，锥孔气流量50 L/ h，定性和定量离子对均为m/z180 ＞ 106.

2.3 脑脊液采集

采用直接穿刺小脑延髓池法[10].以10%水合氯醛，按照3.5 mL/ kg 剂量腹腔注射麻醉大鼠，再以脑立体定位仪固定大鼠头部，调节大鼠鼻尖，使其头部伸直.接着以眼科剪在大鼠两耳之间横向剪开一个1.5-2 cm 的切口，再在颈部纵向剪一个1.5-2 cm 的切口，形成一个“T”字型切口.以镊子钝性剥离肌肉夹层使枕骨大孔暴露在视野中，完成后，以止血钳将两侧肌肉夹紧并拉向两侧，使操作视野完全暴露.以1 mL 注射器在正中线枕骨棘下约3 mm 处缓慢进针，至感受到落空感为止，缓慢抽取脑脊液约100 μL，置于1.5 mL 离心管中，并迅速转移至-80℃条件下储存.

2.4 储备溶液和工作溶液配制

精密称取4-(4-氨基苯基)丁酸对照品10.0 mg，置于10.00 mL 容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至瓶颈刻度处定容，作为储备溶液，置于4℃冰箱中储存.精密量取4-(4-氨基苯基)丁酸储备液，以乙腈稀释为浓度分别为60 ng/ mL、200 ng/ mL、400 ng/ mL、1 000 ng/ mL、2 000 ng/ mL、4 000 ng/ mL、8 000 ng/ mL、12 000 ng/ mL、16 000 ng/ mL、20 000 ng/ mL 的工作溶液，置于4℃冰箱中备用.

2.5 样品处理

取空白脑脊液200 μL，置于1.5 mL 离心管中，加入200 μL 工作溶液，涡旋混匀1 min，离心10 min（12 000 r/ min，4℃），取上清液，进样分析.空白脑脊液样品制备，以乙腈替换工作溶液.

2.6 专属性

取空白脑脊液样品与添加工作溶液的样品，在本文分析条件下进样分析，通过谱图比对发现，4-(4-氨基苯基)丁酸的保留时间为1.98 min，且空白脑脊液中内源性物质不干扰其测定，即采用该检测方法，化合物的保留时间是一定的，即使存在脑脊液的干扰，此化合物的保留时间仍然是保持一致的，说明此检测方法对于此化合物具有专属性.色谱图见图1，结构式及质谱图见图2.

图1 4-(4-氨基苯基)丁酸的色谱图

图2 4-(4-氨基苯基)丁酸的结构式和质谱图

2.7 标准曲线和定量下限

取200 L空白脑脊液，加入200 L不同浓度的工作溶液，涡旋混匀，获得浓度分别为30 ng/ mL、100 ng/ mL、200 ng/ mL、500 ng/ mL、1 000 ng/ mL、2 000 ng/ mL、4 000 ng/ mL、6 000 ng/ mL、8 000 ng/ mL 和10 000 ng/ mL 的溶液，按前面2.5 节的样品处理方法操作，进样分析.以4-(4-氨基苯基)丁酸的峰面积为y轴，以4-(4-氨基苯基)丁酸的浓度为x轴，经线性回归，得标准曲线方程：y=218 080x+27 920（R2=0.999 0，n=10），结果表明，4-(4-氨基苯基)丁酸浓度在30-10 000 ng/ mL 范围内有良好的线性关系，定量下限为30 ng/ mL.

2.8 准确度和精密度

取不同浓度的工作溶液，按前面2.5 节的样品处理方法操作，配制成低、中、高浓度分别为100 ng/ mL、2 000 ng/ mL、8 000 ng/ mL 的质控样品，进样分析.每个浓度设置5 个平行样品，连续测定3 天，根据标准曲线计算质控样品的浓度，计算相对偏差、日内精密度和日间精密度，结果见表1.

表1 大鼠脑脊液中4-(4-氨基苯基)丁酸浓度测定的准确度和精密度

2.9 提取回收率

取不同浓度的工作溶液，按2.5 节的样品处理方法配制成低、中、高浓度分别为100 ng/ mL、2 000 ng/ mL、8 000 ng/ mL 的质控样品，每个浓度设置5 个平行样品A；另取五个独立空白样品，以乙腈直接稀释工作溶液，至样品终浓度分别为100 ng/ mL、2 000 ng/ mL、8 000 ng/ mL，再经涡旋混匀1 min，离心10 min（12 000 r/ min，4℃），取上清液获得样品B.以相应浓度的样品A 与样品B 进样，分析所得的色谱峰面积之比计算提取回收率，2 个浓度的提取回收率分别为70.26%、85.34%和81.49%.

2.10 稳定性

取不同浓度的工作溶液，按2.5 节的样品处理方法配制成低、中、高浓度分别为100 ng/ mL、2 000 ng/ mL、8 000 ng/ mL 的质控样品，每个浓度设置15 份平行样品，其中10 份样品置于自动进样器中，5 份于0 h，5 份于24 h，进样分析，3 个浓度下RSD 均小于8%.同时，另外5 份样品，放在-20℃下冷藏24 h，反复冻融3 次后进样分析，3 个浓度下RSD 均小于9%.结果表明，在室温下保存或冷藏和反复冻融条件下，4-(4-氨基苯基)丁酸均具有较好的稳定性.

2.11 实验样品测定

将35 只清洁级SD 大鼠随机分配为7 组，每组5 只.通过腹腔注射，给予每只大鼠4-(4-氨基苯基)丁酸（30 mg/ kg），并于给药后0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h 共计7 个时间点抽取大鼠脑脊液，按2.5 节的样品处理方法处理后，进样分析，计算大鼠脑脊液中4-(4-氨基苯基)丁酸的浓度.以大鼠脑脊液中药物浓度为纵轴，时间为横轴，绘制药-时曲线，见图3.

结果（见图3）显示，4-(4-氨基苯基)丁酸在腹腔给药1 h 后，脑脊液中药物浓度即达到有效浓度2 μg/ mL，在给药4 h 后达到峰值，约7 μg/ mL.一次腹腔给药30 mg/ kg 后，在大鼠脑脊液中能维持有效浓度约6 h.这表明4-(4-氨基苯基)丁酸能够很好地通过血脑屏障，并在脑脊液中发挥药效.

图3 大鼠脑脊液中4-(4-氨基苯基)丁酸的药-时曲线图

3 讨 论

3.1 流动相的选择

采用甲醇-水体系、甲醇-甲酸水体系、乙腈-水体系、乙腈-甲酸水体系作为流动相，发现相较于甲醇，使用乙腈可以获得更好的峰形.尤其值得关注的是，当流动相体系中不加入甲酸时，目标化合物在色谱图上会出现双峰，这可能与目标化合物同时存在氨基和羧基有关，在中性条件下同时以两种形态存在，故流动相选择乙腈-甲酸水体系.

3.2 样品前处理方法的选择

在样品前处理过程中，用乙腈、甲醇等多种有机溶剂为蛋白沉淀剂，结果表明乙腈效果最好，甲醇沉淀效果较差，所以最终选定乙腈为蛋白沉淀剂，以1 倍脑脊液样品体积的乙腈沉淀蛋白，离心后取上清液进样分析.该前处理方法便利、快捷，有望满足今后大量样本分析的需要.

4 结 语

本文首次建立了采用HPLC-MS/MS 方法测定大鼠脑脊液中4-(4-氨基苯基)丁酸浓度的方法，该方法标准曲线在30-10 000 ng/ mL 范围内线性良好，回归方程的相关系数在0.999 0 以上，方法准确且稳定，样品前处理过程简单，只需要一步沉淀和简单涡旋离心即可.本文构建的分析方法，可为其他类似药物的测定提高参考.