尼勒克县新疆黑蜂蜂蜜游离氨基酸的测定及分析

师丰丰，尹 欣,2, ，张海峰，张 敏，张致豪,4，张金振，周金慧, ，孙丽萍,

（1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；3.尼勒克县种蜂场，新疆伊犁 835700；4.福建农林大学动物科学学院（蜂学学院），福建福州 350002）

蜂蜜主要成分为葡萄糖、果糖和水，此外还有蛋白质、氨基酸、多酚、有机酸和矿物质等[1−3]。蜂蜜中氨基酸来源有花粉、花蜜和蜜蜂等，其约占蜂蜜的1%，通常脯氨酸可占总氨基酸50%以上[4−5]。氨基酸是蛋白质的组成原料，是蜜源植物所必需的营养物质，影响蜜源植物生长发育，同时也是人体所需营养物质之一[6−7]。氨基酸分为必需氨基酸和非必需氨基酸，必需氨基酸为机体所需，但人体无法自身合成，只能从自然界获取，成人所需必需氨基酸共有8 种，分别为赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸，婴儿必需氨基酸除此之外还包括组氨酸[8−10]，药效氨基酸是人体不能合成，但又可维持机体氮平衡的氨基酸[11]。游离氨基酸是蜂蜜中的重要营养组成成分，为蜂蜜植物来源及其品质质量提供重要信息[12−14]，也是一类重要的风味物质，对蜂蜜滋味口感具有一定的影响作用，是食品品质评价的重要指标[15]。

蜂蜜中游离氨基酸测定方法主要包括气相色谱技术（包括气相色谱技术[16]（GC）和气相色谱-质谱[5]（GC-MS）等）和液相色谱技术（包括液相色谱串联质谱[17]（LC-MS/MS）、反向高效液相色谱[4]（RP-HPLC）、高效液相色谱-荧光检测器[18]（HPLC-FLD）和亲水相互作用色谱-液相色谱[19]（HILIC-HPLC）等）。由于蜂蜜中游离氨基酸主要来源于植物花蜜和花粉，因此，可通过各游离氨基酸组分含量进行蜂蜜蜜种及地理源区分。GILBERT 等[16]对产自英国、澳大利亚、阿根廷和加拿大的45 份蜂蜜样品中的游离氨基酸进行测定分析，发现其可根据游离氨基酸将不同地区蜂蜜区分开来。SUN 等[4]通过对中国的5 种单花蜂蜜游离氨基酸测定发现，脯氨酸是大多数样品的主要氨基酸，荆条蜜中苯丙氨酸含量较高，且通过化学计量学分析可鉴定单花蜜。尼勒克新疆黑蜂蜂蜜是由新疆黑蜂工蜂采集尼勒克地区各类山花、药用植物等蜜源植物花蜜酿造而成[18,20]，其涵盖尼勒克县域内不同产区（不同沟系）生产蜂蜜。由于当地各沟系蜜源植物分布差异较大，以至于其所产蜂蜜口感、气味等各具特色，因此，有必要对其各项营养理化组成含量进行测定和分析。本实验室前期已对尼勒克新疆黑蜂蜂蜜中理化指标和维生素、矿物质等营养物质含量进行了分析探讨，表明尼勒克新疆黑蜂蜂蜜各项营养理化指标富有地方特色，且达到了国内多个富硒蜂蜜地方标准限量，是一种极具开发潜力的地方特色蜜种[20]。

蜂蜜中游离氨基酸种类较多，逐一分析较为困难，积极利用相关统计方法，简单明了地显示数据特色与结果显得尤为重要。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种统计方法，通过正交变换将一组可能存在相关性的变量转换为一组线性不相关的变量，转换后的这组变量称为主成分，抽取出的主成分足以反映原始变量的大部分信息，且所含信息互不重复[21]。聚类分析（cluster analysis）是一种无监督学习的统计方法，无需提前设定类或标记，由聚类学习算法自动对数据进行聚类的过程，能够衡量不同数据源之间的相似性[22]。本研究测定了尼勒克7 个产区新疆黑蜂蜂蜜中游离氨基酸含量，对其进行差异显著性分析，并利用主成分分析和聚类分析考察尼勒克新疆黑蜂蜂蜜的主要游离氨基酸和各产区蜂蜜间的差异情况。本研究探讨了尼勒克地区7 个产区新疆黑蜂蜂蜜的游离氨基酸特色，以及其与当地蜜源植物多样性和蜂蜜品质多样性之间的可能关系，同时分析了利用游离氨基酸差异区分不同产区尼勒克新疆黑蜂蜂蜜的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

尼勒克新疆黑蜂蜂蜜采集自尼勒克种蜂场7 个不同产区（阿斯郎沟、寨布拉沟、小蜂场沟、狗熊沟、老布隆沟、塔灯沟、依森布谷沟），并依次记为A1、A2、A3、A4、A5、A7 和A8，其中A6 未获得样品，于2019 年7~8 月采集，置于−20 ℃保存至检测[20]；磷酸二氢钠、氢氧化钠、硼酸 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；浓盐酸 分析纯，北京化学试剂研究所有限责任公司；甲醇、乙腈 色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；0.22 μm 滤膜 天津市津腾实验设备有限公司。

LC-20AD 高效液相色谱仪 日本岛津公司；PHS-3E pH 计 上海仪电科学仪器股份有限公司；Milli-Q Advantage A10 超纯水仪 法国默克公司。

1.2 游离氨基酸测定

依据SN/T 5223-2019 蜂蜜中18 种游离氨基酸的测定—高效液相色谱-荧光检测法[23]中相关方法进行测定。称取3.0 g 蜂蜜，10 mL 超纯水充分溶解，超纯水定容至25 mL，取1 mL 溶液过0.22 μm滤膜，上机检测。以0.1 mol/L 的盐酸溶液配制浓度为500 pmol/μL 混标储备液，再以同样溶剂分别稀释至 0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0 pmol/μL 的混合标准溶液。色谱柱为氨基酸分析柱，150 mm×4.6 mm（内径），3.5 μm；柱温：40 ℃；自动进样器：定量环规格为100 μL；流动相：A%（磷酸二氢钠缓冲溶液），B%（乙腈:甲醇:水=45:45:10（v/v/v））。

蜂蜜中游离氨基酸的含量按照以下公式计算：

式中：X：试样中游离氨基酸的含量， mg/kg；A：被测样品中游离氨基酸的峰面积；b：标准曲线方程的截距；k：标准曲线方程的斜率；D：二次稀释倍数；V：样品的定容体积， mL；m：试样的质量， g。

1.3 数据处理

所有数据均进行三次平行测定，结果以平均值±标准差表示。方差显著性（P＜0.05）通过SPSS 26.0 分析，主成分和聚类分析通过SAS 9.4 软件计算分析。采用Origin Pro 2021 软件和Excel 软件作图。

2 结果与分析

2.1 新疆黑蜂蜂蜜游离氨基酸组分分析

游离氨基酸混合标准品色谱图和尼勒克新疆黑蜂蜂蜜中游离氨基酸色谱图如图1 所示。尼勒克7产区新疆黑蜂蜂蜜游离氨基酸含量检测结果如表1所示，A3 产区总游离氨基酸含量为805.94 mg/kg，显著（P＜0.05）高于其他6 个产区（458.98~619.82 mg/kg）；总游离氨基酸含量最低的产区为A1、A2 和A7，含量不到500 mg/kg，显著低于其他各产地（P＜0.05）。云南6 种单花蜂蜜（桔花蜜、紫云英蜜、苦刺花蜜、槐花蜜、姚安硬蜜和桉树蜜）的总游离氨基酸含量为441.29~713.00 mg/kg[24]，本研究中A2（459.98 mg/kg）和A7 产区（458.98 mg/kg）游离氨基酸含量与姚安硬蜜（441.29 mg/kg）相当，A5 产区（619.82 mg/kg）游离氨基酸含量与槐花蜜（615.86 mg/kg）相当，A3 产区（805.94 mg/kg）游离氨基酸含量高于桉树蜜（713.00 mg/kg）。

图1 游离氨基酸色谱图Fig.1 Chromatogram of free amino acids注：a：混合游离氨基酸标准品；b：尼勒克新疆黑蜂蜂蜜中游离氨基酸；1：天冬氨酸；2：谷氨酸；3：丝氨酸；4：组氨酸；5：甘氨酸；6：苏氨酸；7：精氨酸；8：丙氨酸；9：酪氨酸；10：缬氨酸；11：蛋氨酸；12：苯丙氨酸；13：异亮氨酸；14：亮氨酸；15：赖氨酸；16：脯氨酸。

尼勒克7 产区蜂蜜均以脯氨酸（135.28~206.75 mg/kg）和苯丙氨酸（83.28 ~321.43 mg/kg）为主要游离氨基酸，二者含量占总游离氨基酸的58.15%~65.95%，其中A1、A2、A4 和A7 产区脯氨酸含量高于苯丙氨酸，而A3、A5 和A8 产区二者正相反。A3 产区苯丙氨酸含量为321.43 mg/kg，占A3 产区总游离氨基酸的39.88%，为7 个产区中最高，约为含量最少的A1 产区（83.28 mg/kg）的4 倍；同时，脯氨酸含量为206.75 mg/kg，酪氨酸含量为80.33 mg/kg，均显著高于其他6 个产区（P＜0.05）；其丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸亦为7 个产区最高。文献显示蜂蜜中含量较多的游离氨基酸通常为脯氨酸，占总游离氨基酸的50%左右，其次为苯丙氨酸[25]，有些蜂蜜由于蜜粉源植物等因素苯丙氨酸会高于脯氨酸[18]，本研究中尼勒克县7 产区新疆黑蜂蜂蜜苯丙氨酸含量也相对较高，A3、A5 和A8 产区含量超过脯氨酸，尤其在A3和A8 产区脯氨酸含量仅占总游离氨基酸的25%左右，而苯丙氨酸含量则占到40%左右。蜂蜜中脯氨酸的来源之一为蜜蜂，而新疆黑蜂蜂蜜中脯氨酸含量占比较低的原因可能有新疆黑蜂蜂种本身的因素以及当地蜜粉源植物中苯丙氨酸等较高[25]的因素，可待进一步研究解析。

2.2 氨基酸评价

2.2.1 必需氨基酸（EAA） 根据FAO/WHO 提出的理想蛋白质标准以人体必需氨基酸（EAA）含量占总氨基酸（TAA）含量的40%左右，必需氨基酸（EAA）与非必需氨基酸（NEAA）比例在60%以上为佳[26]。由表1 可知，尼勒克7 个产区新疆黑蜂蜂蜜中EAA/TAA 为33.73%~51.84%，其中，以A2、A4 和A7 产区新疆黑蜂蜂蜜EAA/TAA 更加接近40%；EAA/NEAA 在50.89%~107.66%之间，尤其A3、A5 和A8 占比高达90%以上，因此，尼勒克新疆黑蜂蜂蜜具有较好的营养补充潜力。

表1 新疆黑蜂蜂蜜游离氨基酸含量（mg/kg）Table 1 The content of free amino acid of Xinjiang Black bee honey (mg/kg)

2.2.2 药效氨基酸（MAA） 由表1 可知，7 个产区新疆黑蜂蜂蜜中药效氨基酸含量在37.92%~57.94%之间，其中，A3、A5 和A8 产区药效氨基酸占比在51.36%~57.94%之间，与冬虫夏草[27]药效氨基酸含量相似，高于红枣[28]药效氨基酸含量，具有良好的药效活性。

图2 为尼勒克7 产区新疆黑蜂蜂蜜中各药效氨基酸占总药效氨基酸的比例。由图2 可知，苯丙氨酸为主要的药效氨基酸，占总药效氨基酸的46.43%~75.34%，除A1 产区（46.43%）和A7 产区（48.06%）外，其他各产区药效氨基酸中苯丙氨酸占比均大于54%，其中，A3 产区更是达到75.34%；除苯丙氨酸外，占总药效氨基酸含量较高的分别是谷氨酸（6.03%~14.45%）和赖氨酸（4.85%~11.75%），谷氨酸在A1 和A7 产区蜂蜜药效氨基酸中占比较高，分别为10.08%和14.45%；赖氨酸在A1 和A2 产区蜂蜜药效氨基酸中占比较高，分别为11.75%和10.16%；精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸和甘氨酸在各产区蜂蜜药效氨基酸中占比均低于10%。

图2 新疆黑蜂蜂蜜各药效氨基酸占比Fig.2 The proportion of each pharmacodynamic amino acid of Xinjiang Black bee honey

综上所述，可推测尼勒克新疆黑蜂蜂蜜中主要发挥药效作用的氨基酸为苯丙氨酸，在A1 产区蜂蜜中谷氨酸和赖氨酸效用仅次于苯丙氨酸，A2 产区黑蜂蜂蜜中为赖氨酸，A7 产区黑蜂蜂蜜中为谷氨酸。研究表明苯丙氨酸能够提高人体血液中胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）浓度，从而降低十二指肠蠕动，影响机体食欲[29−30]；谷氨酸能够增强学习和记忆能力、解毒保肝，还可以治疗神经损伤、癫痫等疾病[31−32]；赖氨酸能够促进钙吸收、提升智力、促进生长发育[11]；亮氨酸能够改善癌症等引起的恶病质，包括肌肉萎缩、营养不良、炎症等[33−34]。

2.2.3 呈味氨基酸

2.2.3.1 呈味氨基酸含量 食品中游离氨基酸根据呈味特征可以分为四大类，分别是鲜味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸）、甜味氨基酸（苏氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸和脯氨酸）、苦味氨基酸（蛋氨酸、精氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）和芳香氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸）[11]。对尼勒克地区新疆黑蜂蜂蜜中呈味氨基酸含量进行统计分析，结果如图3所示。

图3 新疆黑蜂蜂蜜各产区呈味氨基酸含量Fig.3 Contents of taste-active amino acids in different production areas of Xinjiang Black bee honey

由图3 可知，A3（782.88 mg/kg）和A5 产区（601.99 mg/kg）新疆黑蜂蜂蜜呈味氨基酸总含量较高；A3 产区显著高于其他6 个产区（P＜0.05），或许可得出A3 产区蜂蜜具有更加丰富的口味；A4（499.41 mg/kg）和A8 产区（505.61 mg/kg）间呈味氨基酸含量无显著性差异（P＜0.05）；A1（451.56 mg/kg）、A2（445.38 mg/kg）和A7 产区（444.84 mg/kg）呈味氨基酸含量最低，且相互无显著性差异（P＜0.05）。

2.2.3.2 呈味氨基酸含量滋味特征 根据鲜味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸和芳香氨基酸分类，对7 个产区蜂蜜中氨基酸含量进行计算，并通过雷达图直观显示不同产区蜂蜜中各类氨基酸含量差异，结果如图4 所示。雷达图是一种可将多种维度数据在二维平面上直观显示的图示，便于人们观察总结各样本点之间的关系特点，从而做出归纳分类[35]。

图4 新疆黑蜂蜂蜜各产区不同滋味氨基酸分布Fig.4 Distribution of amino acids with different flavors in different production areas of Xinjiang Black bee Honey

由图4 可知，尼勒克7 个产区蜂蜜的呈味氨基酸主要以甜味氨基酸和芳香氨基酸为主，鲜味氨基酸和苦味氨基酸较少且各产区蜂蜜中都相对均衡。A1、A2 和A7 产区蜂蜜主要以甜味氨基酸为主，其中脯氨酸（169.82~195.24 mg/kg）含量贡献最大；A4 产区蜂蜜甜味氨基酸（237.71 mg/kg）略高于芳香氨基酸（166.88 mg/kg）；而A3 产区蜂蜜主要以芳香氨基酸苯丙氨酸（321.43 mg/kg）为主；A5 产区蜂蜜甜 味 氨 基 酸（ 250.74 mg/kg） 和 芳 香 氨 基 酸（242.84 mg/kg）含量相对均衡；A8 产区蜂蜜则芳香氨 基 酸（ 222.54 mg/kg） 略 高 于 甜 味 氨 基 酸（176.03 mg/kg）。二者含量的差异可能对尼勒克7个产区新疆黑蜂蜂蜜丰富的口感发挥一定的作用。

2.3 主成分分析

将尼勒克7 个产区（A1~A5、A7、A8）的蜂蜜依次记为1~7，对检测到的16 种氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸）依次编号为X1-X16，进行主成分分析，以探讨尼勒克地区新疆黑蜂蜂蜜中主要游离氨基酸组成成分。

主成分分析主要运用于对数据进行降维分析，用较少的变量解释全部数据变量，Z1、Z2……Z15、Z16 依次代表对原始数据经运算后按方差贡献率排序的主成分值，结合表2 方差累计贡献率高于86.08%和陡坡图（图5），选取前3 个主成分用来解释全部数据变量。由表3 可知，主成分Z1 与丝氨酸、组氨酸和甘氨酸相关性较强，其方差贡献率为51.91%；主成分Z2 与谷氨酸和蛋氨酸相关性较强，其方差贡献率为22.30%；主成分Z3 与苏氨酸、精氨酸和亮氨酸相关性较强，其方差贡献率为11.86%。

表2 相关矩阵特征值Table 2 Correlation matrix eigenvalues

表3 主成分分析特征向量Table 3 Principal component analysis eigenvectors

图5 主成分分析scree plot 图Fig.5 Scree plot of principal component analysis

2.4 聚类分析

以测得的尼勒克7 个产区新疆黑蜂蜂蜜中16 种游离氨基酸为变量，采用SAS 9.4 聚类分析对七个产区新疆黑蜂蜂蜜进行聚类，各产区之间聚类距离越远，其各类间区分越好，结果见图6。16 种游离氨基酸聚类分析结果显示，当聚类距离在0.9~1.5 之间时，七个产区被分为两类，A3 产区（图中OB3）为一类，其他产区为一类；当聚类距离在0.5~0.8 之间时，七个产区被分为三类，A3 产区为一类，结合检测数据可知该类蜂蜜游离氨基酸总量远高于其他产区蜂蜜，芳香氨基酸含量高于其他产区，A5（图中OB5）和A8（图中OB7）产区为一类，该类蜂蜜氨基酸总量及呈味氨基酸总量均仅次于A3 产区蜂蜜，亮氨酸含量明显高于其他产区，其他产区为一类，该类蜂蜜氨基酸总量最低，但其药效氨基酸中甘氨酸和蛋氨酸含量较高。

图6 聚类分析树状图Fig.6 Dendrogram of cluster analysis注：OB1、OB2、OB3、OB4、OB5、OB6、OB7 依次代表尼勒克县A1、A2、A3、A4、A5、A7、A8 产区蜂蜜。

3 结论

本研究采用行业标准方法对尼勒克7 个产区的新疆黑蜂蜂蜜中18 种游离氨基酸进行测定分析，结果表明：所有产区均检测到16 种游离氨基酸，其总含量为458.98~805.94 mg/kg，A3 产区蜂蜜中游离氨基酸含量（805.94 mg/kg）远超其他6 个产区（≤619.82 mg/kg），聚类分析显示，A3 产区独立成类，与其他产区能够完美分离。尼勒克新疆黑蜂蜂蜜游离氨基酸具有较高的药效氨基酸占比（37.92%~57.94%），其主要药效氨基酸为苯丙氨酸；呈味氨基酸以芳香族氨基酸和甜味氨基酸为主，但各产区间二者含量差异较大，A3 产区呈味氨基酸总量也是远高于其他6 个产区，各产区间游离氨基酸种类及含量的变化体现出当地蜜源植物的多样性，本研究将为解析尼勒克地区新疆黑蜂的蜂蜜特色提供科学数据，为地方蜂蜜产业宣传及发展提供理论依据。