氨氮和镉胁迫对芙蓉鲤鲫抗氧化系统和免疫机能的影响

高金伟 吴 浩 李绍明 谢 敏 李文祥 宋 锐

(1. 湖南省水产科学研究所, 长沙 410153; 2. 农业农村部淡水养殖病害防治重点实验室, 武汉 434072)

鱼类作为低等水生脊椎动物, 其呼吸、排泄和生长发育等生命过程均在水环境中进行, 并对水体环境产生一定的影响。同样的, 水体中的各种环境因子(如氨氮、重金属和溶解氧)也会影响鱼体的生命活动。氨氮作为水体中常见的环境污染因子之一, 主要来源于农业径流、水中残饵及排泄物的氨化作用, 可通过鳃等器官进入鱼体, 对鱼类有很强的毒性作用[1,2], 可显著影响鱼类的生长速率[3]、抗氧化能力[2]、免疫力[4]和组织器官结构[1]等, 扰乱鱼体正常的生理活动和新陈代谢, 严重的可导致死亡。近年来, 随着有色金属的开采和冶炼、印染、农药、饲料等行业的迅猛发展, 大量重金属污染物通过多种途径进入水生生态系统, 严重威胁水生生物的生存, 并通过食物链间接影响人类健康和食品安全[5]。重金属镉作为生物体内非必需的微量金属元素, 对动物有较强的致畸、致癌和致突变作用,是生物毒性最强的重金属元素, 已被联合国环境规划署(UNEP)列为十二种全球性环境污染物之首[6]。水体中的镉经过溶解、沉淀等一系列反应后, 在水体和沉积物中迁移、转化, 并随着灌溉用水和养殖池塘换水向农田和养殖水域扩散。此外, 部分镉污染农田经工程化改造后用于稻田综合种养和池塘工程化养殖, 因此, 水体中的鱼类等水生动物均遭受着不同程度的镉胁迫。镉在生物体内难以降解,具有蓄积毒性, 可通过食物链和食物网产生生物富集和生物放大效应, 严重危害水生动物的健康和水产品质量安全, 可引起鱼类等水生动物发育畸形[7]、生殖内分泌紊乱[8]、氧化代谢酶活性降低[9]、免疫功能抑制[10]和组织器官损伤[11]等生理副作用。

鱼类作为水域生态系统的重要组成部分, 其生理活动极易受到水源性化学污染物(氨氮、镉)的影响。为抵御环境污染物的氧化胁迫, 鱼类已进化出一套由超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等抗氧化酶及谷胱甘肽(GSH)和维生素C (Vc)等抗氧化剂组成的氧化防御系统[12]。但当胁迫因子的强度和持续时间超过鱼体自我防御的能力时, 鱼体中过量产生的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)会攻击蛋白质、脂质和核酸等生物大分子, 产生大量的脂质过氧化物, 诱导氧化应激, 进而导致机体非特异性免疫能力下降[13]。芙蓉鲤鲫(Cyprinus capiofurong.♀×Carassius auratusred var.♂)为湖南省水产科学研究所自主培育的新型杂交品种, 目前已通过池塘养殖、网箱养殖和稻田养殖等养殖模式在湖南、湖北、甘肃和天津等24个省(市)示范推广[14]。芙蓉鲤鲫食性杂, 极易受到环境重金属的污染, 同时其抗逆性强, 养殖密度大, 养殖水体中氨氮浓度较高, 因此芙蓉鲤鲫是研究镉和氨氮胁迫的良好材料。目前, 国内外关于氨氮和镉单独胁迫对鱼类抗氧化系统及免疫力影响的研究报道较多[2—4,10,11], 但关于氨氮和镉联合胁迫对芙蓉鲤鲫抗氧化功能和免疫机能影响的研究尚未见报道。研究表明, 水体中高浓度的氨氮常与高浓度的重金属和有机污染物共同存在[15], 因此鱼类可能同时面临多种污染物的胁迫。目前, 越来越多的学者关注环境污染物联合胁迫对鱼类生理机能和抗氧化状态的影响, 但大部分为两种重金属及重金属与有机污染物的联合胁迫[16,17],有关镉和氨氮联合胁迫的研究却鲜见报道。

本研究以芙蓉鲤鲫为实验对象, 以镉和氨氮为胁迫源, 采用静水生物试验法研究氨氮和镉单一胁迫和联合胁迫下芙蓉鲤鲫肝脏抗氧化能力和免疫力的变化规律, 探讨不同胁迫条件下芙蓉鲤鲫的抗逆机制和免疫调节机制, 以期为芙蓉鲤鲫的健康养殖及环境污染物的风险评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

芙蓉鲤鲫取自湖南省水产科学研究所长沙基地, 鱼体健壮, 活力强, 体表无损伤, 体质量(32.75±3.53) g, 体长(10.13±0.89) cm。实验开始前在规格为95 cm×60 cm×50 cm的玻璃缸中暂养7d, 试验用水为经充分曝气72h的地下井水, 水温(27±1)℃, pH(7.8±0.2), 溶解氧(4.5±0.5) mg/L, 24h连续增氧, 每天定时投喂颗粒饲料和换水排污。

氯化铵(NH4Cl, 纯度≥99.5%)和氯化镉(CdCl2·2.5H2O, 纯度≥99.0%)购自国药集团化学试剂有限公司; 总蛋白(TP)测定试剂盒(带标准: 考马斯亮蓝法, A045-2-2), 总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(WST-1法, A001-3-2), 过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(可见光法, A007-1-1), 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测定试剂盒(比色法, A005-1-2), 还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(微板法, A006-2-1), 碱性磷酸酶(AKP)测定试剂盒(微板法, A059-2-2), 酸性磷酸酶(ACP)测定试剂盒(微板法, A060-2-2)和髓过氧化物酶(MPO)测试盒(比色法, A044-1-1)均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 实验方法

采用静水染毒法, 分别以分析纯氯化铵和氯化镉为氨氮源和镉源, 按照NH4+离子浓度和Cd2+离子浓度分别配制成浓度为5和1 g/L的母液, 根据试验需求稀释至所需浓度。 通过预实验得出芙蓉鲤鲫96h氨氮和镉半致死浓度(96hLC50)分别为25.64和112.81 mg/L, 以96hLC50的10%为安全浓度, 则氨氮和镉对芙蓉鲤鲫的安全浓度分别为2.56和11.28 mg/L。在此基础上, 本研究设置4个处理组, 分别为空白对照组(Control)、氨氮胁迫组(NH3-N, 2.56 mg/L)、镉胁迫组(Cd, 11.28 mg/L)及氨氮和镉联合胁迫组(NH3-N+Cd)。每个处理组设置3个平行, 每个平行15尾鱼, 每天换水50%, 并用相应母液调整至设定浓度。实验期间, 水温(27±1)℃, pH (8.2±0.2),光暗比为14h∶10h, 水中溶解氧保持在5 mg/L以上,每天饱食投喂两次(8:00和16:00), 每次投喂1h后捞出残余饲料, 每天定时用电动虹吸泵清除粪便。分别于第0、第2、第4、第6和第8天随机取6尾鱼, 经40 mg/L苯唑卡因麻醉后, 于冰上取肝脏组织若干,-20°C冻存。

1.3 肝脏抗氧化指标和免疫指标的测定

肝脏组织按照1∶9 (w/v)的比例用预冷的0.85%生理盐水研磨匀浆, 3000 r/min离心后取上清液, 按照试剂盒说明书的要求, 分别测定肝脏TP、MDA和GSH的含量及SOD、CAT、GSH-PX、AKP、ACP和MPO的活性。

1.4 数据统计分析

数据结果均以平均值±标准差(mean±SD)呈现,采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析, 并选用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan法进行多重比较分析,P＜0.05为显著性差异水平。

2 结果

2.1 肝脏抗氧化指标

芙蓉鲤鲫亚急性胁迫2d后, NH3-N组和Cd组中肝脏MDA含量显著高于对照组(P＜0.05), 分别为对照组的5.68和2.84倍, 而NH3-N+Cd组中肝脏MDA含量略高于对照组, 但差异未达到既定的显著性水平(P＞0.05)。在胁迫4d后, 仅NH3-N+Cd组肝脏MDA含量相较于对照组显著增加(P＜0.05), 为对照组的1.73倍, 其余两个处理组肝脏MDA含量相较于对照组有所增加, 但未达到显著水平(P＞0.05)。在胁迫6d后, Cd组MDA含量相较于对照组显著增加(P＜0.05)。在胁迫8d后, NH3-N组、Cd组和NH3-N+Cd组肝脏MDA含量均显著高于对照组, 分别为对照组的2.24、3.85和3.61倍(P＜0.05)。在整个实验期间, 3个处理组肝脏MDA含量在不同时间点整体呈现“升-降-升”的变化规律(图 1), NH3-N组、Cd组和NH3-N+Cd组肝脏MDA含量分别在第2、第8和第8天达到峰值。对照组MDA含量在不同时间点均无显著变化。

图1 氨氮和镉胁迫对芙蓉鲤鲫肝脏丙二醛含量的影响Fig. 1 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on malondialdehyde (MDA) content in liver of Furong crucian carp

与对照组相比, NH3-N组在2d时肝脏SOD活性达到峰值(图 2), 为对照组的2.29倍(P＜0.05), 随后显著下降, 至4d时SOD活性仍显著高于对照组(P＜0.05), 在6d时SOD活性处于最低值(P＜0.05), 在4d和6d时SOD活性分别为对照组的1.35和0.55倍, 在0和8d时SOD活性与对照组之间差异无显著性。Cd组在0、2d、4d和8d时SOD活性与对照组之间均无显著性差异, 在6d时SOD活性显著高于对照组(P＜0.05), 为对照组的1.39倍。与对照组相比, NH3-N+Cd组肝脏SOD活性在6d和8d时显著增强(P＜0.05), 分别为对照组的1.44和1.81倍, 在其余时间点均无显著性差异(P＞0.05)。

图2 氨氮和镉胁迫对芙蓉鲤鲫肝脏超氧化物歧化酶活性的影响Fig. 2 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on superoxide dismutase (SOD) activity in liver of Furong crucian carp

芙蓉鲤鲫经不同的胁迫后, 肝脏CAT活性整体呈现先下降后上升的变化趋势(图 3)。NH3-N组、Cd组和NH3-N+Cd组肝脏CAT活性均在2d时开始下降, 但与对照组无显著性差异(P＞0.05), 分别在6d、4d和4d时活性最低, 显著低于对照组(P＜0.05), 在8d时NH3-N组和Cd组CAT活性恢复至正常水平, 而NH3-N+Cd组CAT活性却显著高于对照组(P＜0.05)。在对照组中, 肝脏CAT活性在2d时显著高于其他采样点, 表明样品采集过程中的操作差异可能导致CAT在不同采样点的活性差异。

图3 氨氮和镉胁迫对芙蓉鲤鲫肝脏过氧化氢酶活性的影响Fig. 3 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on catalase (CAT) activity in liver of Furong crucian carp

氨氮和镉单一及联合胁迫后, 芙蓉鲤鲫肝脏GSH-PX活性的变化如图 4所示。在氨氮胁迫2d内,GSH-PX活性显著增加(P＜0.05), 随后显著下降; 在氨氮胁迫8d后, GSH-PX活性恢复至对照组水平。在氨氮胁迫8d内, GSH-PX活性呈现波动变化的趋势, 最大值和最小值分别出现在胁迫后的第2和第6天, 分别为对照组的2.52和0.69倍。在镉胁迫6d后,肝脏GSH-PX活性相较于对照组显著升高, 随后在8d时降至对照组水平。氨氮和镉联合胁迫0—4d,肝脏GSH-PX活性保持基本稳定, 随后在6d和8d时GSH-PX活性持续升高, 均显著高于对照组(P＜0.05)。

图4 氨氮和镉胁迫对芙蓉鲤鲫肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响Fig. 4 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on glutathione peroxidase (GSH-PX) activity in liver of Furong crucian carp

如图 5所示, 氨氮胁迫后芙蓉鲤鲫肝脏GSH含量在2d时显著增加(P＜0.05), 为对照组的1.98倍, 在4d、6d和8d时肝脏组织中的GSH维持着较低的含量, 均显著低于对照组(P＜0.05), 分别为对照组的0.27、0.19和0.57倍, 其中在6d时有最小值。在镉胁迫后, 肝脏GSH含量在4d时显著低于对照组(P＜0.05), 在其他时间点相较于对照组无显著差异(P＞0.05)。在氨氮和镉联合胁迫后, 肝脏GSH含量在2d内无显著变化, 在4d时GSH含量急剧下降, 随后在6d时快速升高, 至8d时仍保持较高的水平, GSH含量在4d、6d和8d时均与对照组有显著差异(P＜0.05),分别为对照组的0.26、1.37和1.66倍。

图5 氨氮和镉胁迫对芙蓉鲤鲫肝脏谷胱甘肽含量的影响Fig. 5 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on glutathione (GSH) content in liver of Furong crucian carp

2.2 肝脏免疫指标

与对照组相比, NH3-N组在2d和4d时肝脏ACP活性显著高于对照组(P＜0.05), 分别为对照组的1.48和1.39倍, 而在0和6d时肝脏ACP活性与对照组相比无显著性差异, 在8d时肝脏ACP活性显著低于对照组(0.68倍)。NH3-N组肝脏ACP活性整体呈先升后降的变化趋势(图 6)。Cd组肝脏ACP活性在0、2d、4d和6d时略有变化, 但相较于对照组均无显著变化(P＞0.05), 至8d时ACP活性急剧升高(P＜0.05), 为对照组的1.70倍。NH3-N+Cd组ACP活性在0、2d和4d时与对照组基本持平, 在6d和8d时ACP活性持续增强, 分别为对照组的1.39和1.84倍(P＜0.05)。

图6 氨氮和镉胁迫对芙蓉鲤鲫肝脏酸性磷酸酶活性的影响Fig. 6 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on acid phosphatase (ACP) activity in liver of Furong crucian carp

与对照组相比, 氨氮胁迫2d后AKP活性急剧升高, 在4d时AKP活性显著降低, 至8d时仍维持着较低的活性水平(图 7)。NH3-N组肝脏AKP活性在2d、4d、6d和8d时相较于对照组均存在显著性差异(P＜0.05), 分别为对照组的6.58、0.39、0.51和0.57倍, 其中2d时达到峰值, 4d时有最小值。Cd组肝脏AKP活性在0—4d内缓慢降低, 但与对照组差异不显著(P＞0.05), 在6d时AKP活性显著降低(P＜0.05), 有最小值, 至8d时AKP活性显著升高, 为对照组的1.27倍。在0—8d内, Cd组肝脏AKP活性呈现先下降后升高的变化趋势。与对照组相比,NH3-N+Cd组芙蓉鲤鲫肝脏AKP活性在8d时显著增强(1.81倍), 0—6d内AKP活性无明显变化。

图7 氨氮和镉胁迫对芙蓉鲤鲫肝脏碱性磷酸酶活力的影响Fig. 7 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on alkaline phosphatase activity (AKP) in liver of Furong crucian carp

与对照组相比, 3个处理组芙蓉鲤鲫肝脏MPO活性均大致呈现先上升后下降的变化趋势, 胁迫2d时均达到最大值(图 8)。NH3-N组MPO活性在2d、4d和6d时显著高于对照组(P＜0.05), 分别为对照组的7.35、4.58和3.16倍, 至8d时恢复至对照组水平。Cd组MPO活性在2d和4d时显著高于对照组(P＜0.05), 分别为对照组的7.54和6.98倍, 在6d和8d时MPO活性略低于对照组, 但未达到显著性水平(P＞0.05)。NH3-N+Cd组MPO活性在2d和8d时显著高于对照组(P＜0.05), 分别为对照组的10.11和6.83倍, 在4d和6d时MPO活性略高于对照组, 均未达到显著性水平(P＞0.05)。

图8 氨氮和镉胁迫对芙蓉鲤鲫肝脏髓过氧化物酶活性的影响Fig. 8 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on myeloperoxidase (MPO) activity in liver of Furong crucian carp

3 讨论

3.1 氨氮和镉胁迫对芙蓉鲤鲫氧化应激状态的影响

鱼体在遭受不利环境因子(氨氮、重金属等)时机体会产生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS), 当超出生物体清除能力时, 过多的ROS会诱导脂质过氧化, 进而引发氧化应激, 最终导致DNA氧化损伤、蛋白质失活和线粒体功能失调, 严重的导致死亡。丙二醛(MDA)作为ROS引发脂质过氧化作用的终产物, 其含量的变化可反映出机体脂质过氧化反应的程度, 是动物体氧化应激和细胞氧化损伤灵敏的生物标志物[18]。研究发现, 亚硝酸盐[19]、低氧[20]、运输[21]及拥挤胁迫[3]均可导致鱼体内MDA含量的升高, 使动物处于氧化应激状态。在本研究中, 氨氮和镉单一及联合胁迫后, 在2d、4d、6d和8d时芙蓉鲤鲫肝脏MDA含量均不同程度的增加, 并维持着较高的水平, 这表明采用水源性亚急性胁迫的方法适宜于建立芙蓉鲤鲫氧化应激模型。余秋果[16]指出, 稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)在铜、镉及其联合暴露后, 肝脏MDA含量显著升高, 鱼体产生了氧化应激, 这与本研究结果一致。

3.2 氨氮和镉胁迫对芙蓉鲤鲫氧化防御系统的影响

鱼类在长期的进化过程中已演化出一套完整的抗氧化系统以抵御外界的不利刺激。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)构筑了鱼类抵御氧化应激的第一道防线, 是鱼体维持内环境稳态的重要酶类。SOD能够高效催化鱼体内的ROS, 并通过歧化反应将其转化为过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)。H2O2仍具有一定的氧化性, 可被CAT和GSH-PX进一步转化为无毒无害的水(H2O)和O2, 以维持鱼体内氧化平衡状态的稳定[22]。在本实验中, 芙蓉鲤鲫肝脏SOD活性在氨氮胁迫2d和4d时显著升高, 在镉胁迫6d时显著高于对照组(P＜0.05), 在氨氮和镉联合胁迫6d和8d时显著升高。研究发现, 安全浓度下的镉、氨氮单一胁迫能够诱导肝脏SOD活性的升高[23—25], 这与本研究结果基本一致。CAT和GSHPX是鱼体内以H2O2为底物的解毒酶, 是机体解毒防御机制、抗逆性及抗氧化功能调节的重要组成部分。在本研究中, 肝脏GSH-PX活性在氨氮胁迫2d和4d时显著增强, 在6d时显著降低, 在镉胁迫6d时显著升高, 在氨氮和镉联合胁迫6d和8d时显著升高, 这与韩春艳等[4]报道的结果相符。CAT活性在所有处理组中均呈现出先降低后升高的变化趋势, 这与前期研究结果基本一致, 如中华鲟(Acipenser sinensis)[26]、大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)[2]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[11]等。本研究结果表明, 氨氮和镉及其联合胁迫条件下, 芙蓉鲤鲫肝脏CAT和GSH-PX均被成功激活, 参与了机体对外源性毒性物质的解毒过程。安全浓度的氨氮胁迫下肝脏GSH-PX活性呈现先升高后降低的变化趋势, 而CAT表现出相反的变化规律, 这可能与酶促反应的底物亲和性有关。研究表明, GSH-PX对反应底物H2O2的亲和力高于CAT, 其在H2O2浓度非常低时也能与之反应[27]。谷胱甘肽(GSH)是一种含有巯基的三肽蛋白, 是生物体内清除ROS非常重要的非酶抗氧化剂, 在清除自由基,缓解氧化应激, 保护细胞完整性, 维持细胞代谢及解毒等生理过程中发挥着重要作用[24,28,29]。在本实验中, 氨氮胁迫后肝脏GSH含量在2d时显著升高,在2d、6d和8d时明显降低, 这说明短时间的氨氮刺激诱使机体表现出一定的毒物兴奋效应, 但随着暴露时间的延长, 机体内积聚的氨氮大量消耗抗氧化物质GSH以缓解氨氮毒性, 从而导致GSH缺乏或耗竭。Hao等[30]报道了氨氮胁迫后红鲫(Carassius auratusred var.)肝脏GSH含量呈先急剧升高后显著降低的变化趋势, 这与本研究结果相符。研究表明,重金属镉能与GSH直接结合形成Cd(GS)2复合物而流出细胞, 在缓解镉毒性的同时降低了细胞内自由基清除剂GSH的含量[31,32]。在本研究中, 肝脏GSH含量在镉胁迫及氨氮和镉联合胁迫4d时显著减少,这表明GSH含量的减少是机体解毒过程中的一种适应性保护机制。

3.3 氨氮和镉胁迫对芙蓉鲤鲫免疫能力的影响

酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)是存在于鱼类等水生动物溶酶体和内膜系统内的磷酸酶,是水生动物体内重要的免疫标志酶和解毒酶类, 广泛参与动物体内细胞吞噬、免疫反应、能量代谢调节、细胞损伤与修复等生命过程, 既是动物体内解毒体系的重要组成部分, 也是动物体免疫机能和健康状况的重要参照指标[33—35]。在本研究中, 氨氮和镉单一及联合胁迫后ACP活性出现不同程度的增强, 而且镉单一胁迫及氨氮和镉联合胁迫在8d时诱导AKP活性的增强, 这表明化学性环境污染物激活了磷酸酶介导的芙蓉鲤鲫的非特异性免疫系统。研究指出, AKP的活性由最适pH决定, 机体组织损伤时AKP活性升高, 当组织严重损伤时, 其活性降低[36]。本研究发现, 氨氮胁迫后AKP活性在2d时显著升高, 在4d、6d和8d时显著降低, 这表明水源性氨氮胁迫改变了芙蓉鲤鲫体内的酸碱度, 对组织器官的结构可能造成严重损伤。此外, 生物体应对外界不利刺激时需要消耗更多的能量, 以满足生物体应激代谢的能量需求。因此, AKP活性的升高是芙蓉鲤鲫应对外界不利因素的一种能量代偿效应, 也是芙蓉鲤鲫耐受氨氮胁迫的一种适应机制,这与封琦等[37]的研究结果基本一致。髓过氧化物酶(MPO)主要存在于人和动物体内的中性粒细胞中, 具有维持机体免疫自稳态的平衡、清除氧自由基、杀灭病原微生物等多种生物活性, 是机体先天免疫和氧化应激保护的重要免疫因子[38,39]。在本研究中, 氨氮和镉单一及联合胁迫均导致肝脏MPO活性显著增强, 这表明外源性化学物质激活了芙蓉鲤鲫的非特异性免疫系统, 提高了机体抵御外界物质干扰和氧化损伤的能力, 有利于维持机体内环境的稳定。

3.4 芙蓉鲤鲫对氨氮和镉的差异性生理响应

肝脏是鱼类重要的解毒器官和重金属蓄积靶器官, 外源性化学物质如氨氮、镉等可以通过鳃、皮肤、肠道等多种途径进入鱼体, 并随着循环系统扩散、转运, 进而影响靶器官的生理功能和物质代谢。本研究发现, NH3-N组ACP、SOD、GSH-PX和GSH的含量变化早于Cd组, 表明氨氮相较于镉更易扩散进入鱼体, 更早地诱导化学胁迫, 这可能是由氨氮和镉的理化性质所决定的。相较于氨氮胁迫, 芙蓉鲤鲫肝脏AKP、SOD、GSH-PX和GSH含量在镉胁迫4d或6d后才出现显著变化, 这从侧面反映出氨氮对芙蓉鲤鲫更多地表现出渗透毒性, 镉对芙蓉鲤鲫更多地表现出蓄积毒性。研究发现, 当两种化学性污染物同时作用于机体时, 其往往通过生物体不同的作用机制和代谢调节等多个途径表现出较为复杂的毒性效应[40]。从本实验结果可以看出, 在胁迫初期, 氨氮胁迫对芙蓉鲤鲫的抗氧化指标和免疫指标产生了不同程度的影响, 而随着胁迫时间的延长, 氨氮胁迫对芙蓉鲤鲫的抗氧化指标和免疫指标的影响有所减弱, 相反镉胁迫及氨氮和镉联合胁迫对芙蓉鲤鲫某些抗氧化指标(如SOD、GSH)和免疫指标(如ACP、AKP)的扰动效应强于氨氮胁迫, 这表明镉胁迫及氨氮和镉联合胁迫可能在芙蓉鲤鲫体内呈现出时间累积效应。因此, 抗氧化酶和免疫酶活性的变化是生物体对外界不利刺激的主动适应, 既表现出鱼体的抗逆能力, 也反映了环境因素引发的鱼体胁迫生理的变化规律。

综上所述, 本研究运用静态毒理学试验法成功构建了芙蓉鲤鲫氧化应激模型。研究结果表明, 氨氮和镉单一及联合胁迫均使芙蓉鲤鲫处于氧化胁迫状态, 改变了鱼体内的氧化平衡状态, 激活了芙蓉鲤鲫的抗氧化防御系统, 活化了AKP、MPO等免疫酶介导的先天免疫反应以增强鱼体的耐逆能力。本研究是对实际复合环境条件下水生动物的生理响应机制和解毒机制的初步探索, 至于复合条件下(胁迫种类、时间)对生物体联合作用效应的分子机制有待进一步探究。