玉屏风多糖合生元对热应激草鱼免疫性能的影响

刘 华 邓桃球 史银魁 于 辉 杨 映 施益如 蔡明烩 段玉婉

(1. 佛山科学技术学院广东省动物分子设计与精准育种重点实验室, 佛山 528225;2. 佛山科学技术学院生命科学与工程学院, 佛山 528225)

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国淡水养殖产量最大的经济鱼类, 具有肉嫩、少刺、营养丰富和口感鲜美等特点。胡宗福等[1]研究表明鱼肉中必需氨基酸含量高、种类丰富。黄春红等[2]研究表明草鱼粗蛋白质和粗脂肪含量高, 口感鲜美。然而,鱼类的体温的调控主要依赖水体温度, 水温的变化可对硬骨鱼的生长和免疫性能产生影响[3,4]。宋文华等[5]研究发现在高温环境下, 草鱼免疫力下降, 从而导致各类疾病发生。水温的急剧变化或者超过鱼类适宜温度范围都会导致鱼类免疫功能的紊乱,使机体无法正常执行免疫功能, 从而增加鱼类对病原体的易感性[6,7]。因此, 提高在高温环境下水产动物免疫性能的研究应用引起高度重视。

玉屏风散是由白术、黄芪和防风三味中草药组成的一种复合中草药, 陈向涛[8]通过活性筛得到玉屏风散最具药理活性的多糖类成分就是玉屏风多糖(Yu-Ping-Feng Polysaccharide), 具有增强水产动物免疫力, 改善肠道形态结构以及促进生长发育等作用[9,10]。益生菌(Probiotics)是指促进其他生物健康的微生物, 如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌在鱼类肠道酸性环境中比较稳定, 既提高机体免疫力又促进鱼类体内的糖代谢水平[11],而嗜热链球菌具有生产胞外多糖(Exopolysaccharide, EPS)的生理特性, 已有文献报道EPS具有抗氧化[12]和免疫调节作用[13]。合生元(Synbiotics)又称合生素, 是使用益生菌和益生素配伍组成的新型微生态制剂[14], 而玉屏风多糖合生元则是益生菌与玉屏风多糖的结合, 两者配合能提高玉屏风多糖的活性成分和生物学效价, 充分发挥出两者间的协同效应。我们前期的研究表明玉屏风多糖和益生菌结合使用对比单独使用复合益生菌更能提高乌鳢(Channa argus)的抗氧化能力和免疫能力[9]。因此,本研究通过制备玉屏风多糖合生元, 改进中药多糖添加剂效果, 研究其对高温条件下草鱼免疫功能的影响, 为其在生产中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

草鱼购自南海百容水产良种有限公司, 无注射疫苗和使用抗生素记录, 平均体重为(20±2) g。复合益生菌由嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和枯草芽孢杆菌按体积为1∶1∶1比例混合后测得嗜酸乳杆菌活菌量为1.0×109cfu/mL, 嗜热链球菌活菌量为1.0×109cfu/mL, 枯草芽孢杆菌活菌量为1.2×109cfu/mL, 菌种均由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供。玉屏风多糖由佛山德众药业有限公司提供。实验饲料配方见表 1。

表1 饲料配方及生化组成(%干物质)Tab. 1 Feed formulation and biochemical composition (% dry matter)

1.2 试验设计与饲养管理

选平均体重(20±2) g 的健康草鱼360尾, 随机分为4组, 即对照组(Ⅰ组)和试验组(Ⅱ—Ⅳ组), Ⅰ组饲喂基础饲料, Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组在基础饲料中分别添加0.08%、0.12%和0.20%玉屏风多糖, 并在饲喂前按复合益生菌体积(mL)/饲料重(g)为 1%的剂量添加复合益生菌(由乳酸菌、嗜热链球菌、枯草芽孢杆菌按体积1∶1∶1比例混合而得)拌料。每组3个重复, 每个重复30 尾。预试期10d, 试验期为21d, 每天保持24h充气增氧, 控制水温在26—28℃, 每天饲喂2次(8:00和17:00), 日投饲量为鱼群总重量的2%—4%, 每次根据摄食情况进行饲喂。

1.3 试验样品的采集与测定方法

试验样品的采集在饲养试验结束后, 从各组随机选择体重基本一致的健康草鱼在充足的溶氧条件下, 对其进行热应激(32—34℃)48h。在热应激0、6h、24h和48h的4个时间点从各组随机抽取3尾草鱼进行心脏采血, 3000 r/min冷冻离心5min,移取上层血清于1.5 mL EP管中, 编号并置于-80℃超低温冰箱中保存备用。在鱼体采血后立即解剖并剥离其肝脏, 编号并置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

血清、肝脏生化指标的测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和肝胰脏样品中总超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(TAOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶(GR)和丙二醛(MDA)含量的测定均按照试剂盒说明书进行。所有试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

草鱼肝脏相关基因表达量的测定分别用试剂盒提取总 RNA 与cDNA反转录, 试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。

以草鱼β-actin为管家基因, 并参考文献[15,16]及NCBI上公布的草鱼Nrf2、Keap1、Cu-Zn SOD、GSH-Px、HSP70、GR、MHCII和IL-8基因设计相应的引物序列(表 2), 并由上海生工公司合成。对所合成的引物进行PCR扩增后, 使用1%凝胶电泳检测样品DNA质量, 并将PCR产物交由上海生物工程有限公司进行测序。

表2 目的基因引物序列Tab. 2 Target gene primer sequence

使用PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)进行定量反应,反应体系20 μL: 2×PerfectStartTMGreen qPCR Super-Mix 10 μL, Passive Reference Dye (50×) 0.4 μL, Forward Primer (10 μmol/L) 0.4 μL, Nuclease-free Water 7.8 μL, Reverse Primer (10 μmol/L) 0.4 μL, cDNA模板 1 μL。反应程序为: 94℃ 预变性30s; 94℃ 5s,60℃ 30s, 72℃ 30s, 40个循环。目的基因相对表达量采用 2-ΔΔCt方法计算。

1.4 数据分析

统计学分析利用SPSS19.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA), 利用DUNCAN氏进行多重比较分析,P＜0.05为差异性标准。

2 结果

2.1 热应激下不同水平玉屏风多糖合生元对草鱼血清生化指标的影响

由图 1可知, 各组ALT活力随时间的延长呈先升高后降低趋势, 在应激后24h时达到最大值, 各组AST活力随时间点的延长呈上升趋势且各时间点间差异显著(P＜0.05), 而各添加YPF-P组ALT和AST活力在应激前后均低于对照组。在应激前,0.12%和0.20%YPF-P组的ALT活力显著低于对照组(P＜0.05), 0.12%YPF-P组AST活力显著低于对照组(P＜0.05)。在应激后, 各添加YPF-P组ALT 活力在应激6h时均显著低于对照组(P＜0.05), 而0.12%YPF-P组在应激后各时间点均显著低于对照组(P＜0.05)。各添加YPF-P组AST活力在应激后各时间点均显著低于对照组 (P＜0.05), 而0.12%YPF-P组在应激48h时显著低于其他3组 (P＜0.05)。

图1 热应激下玉屏风多糖合生元对草鱼血清生化指标的影响Fig. 1 Effect of Yu-Ping-Feng Polysaccharide synbiotics on serum biochemical indexes of grass carp under heat stress

2.2 热应激下不同水平玉屏风多糖合生元对草鱼肝脏生化指标的影响

由图 2可知, 各组SOD、T-AOC、GSH-Px活力在应激后有先升高后降低趋势, 在应激后6h时达到最大值。0.12%和0.20%YPF-P组SOD活力在应激前后均高于对照组, 而0.12%YPF-P组SOD活力在应激前和应激24h时显著高于对照组(P＜0.05)。各添加YPF-P组的T-AOC活力在应激前后均高于对照组, 但无显著性差异(P＞0.05)。各添加YPF-P组的GSH-Px活力和GR活力在应激前后均高于对照组, 而0.12%和0.20%YPF-P组GSH-Px活力在应激6h时显著高于对照组(P＜0.05), 0.12%YPF-P组GR活力在应激前和应激48h时显著高于对照组(P＜0.05)。各组MDA 含量在应激后呈现上升的趋势, 在应激48h时MDA含量显著高于应激前(P＜0.05); 各添加YPF-P组MDA含量在应激前后均低于对照组, 而0.12% YPF-P组MDA含量在应激24h和48h时显著低于对照组(P＜0.05)。

图2 热应激下玉屏风多糖合生元对草鱼肝脏生化指标的影响Fig. 2 Effects of Yu-Ping-Feng Polysaccharide synbiotics on liver biochemical indexes of grass carp under heat stress

2.3 热应激下不同水平玉屏风多糖合生元对草鱼肝脏相关基因表达的影响

由图 3可知, 各组Nrf2相对表达在应激24h和48h时显著高于对照(P＜0.05), 而0.12%和0.20%YPF-P组在应激0和6h时Nrf2相对表达量显著高于对照组(P＜0.05)。除0.12%YPF-P组外其他3组Keap1相对表达在应激24h时显著高于应激前(P＜0.05), 而0.12%和0.20%YPF-P组在应激0、24h和48h时均显著低于对照组(P＜0.05)。各组Cu/Zn-SOD相对表达量在应激48h时显著低于应激前(P＜0.05), 而0.12%和0.20%YPF-P组在应激0h和6h时显著高于对照组(P＜0.05)。各组GSH-Px相对表达量在应激后3个时间点与应激前均无显著性差异(P＞0.05), 而0.12%YPF-P组在应激6h和24h时显著高于对照组(P＜0.05)。各组GR相对表达量在应激48h时显著低于应激前(P＜0.05), 而0.12%和0.20%YPF-P组在应激0h、6h和24h时均显著高于对照组(P＜0.05)。各组HSP70相对表达量在应激24h和48h时显著高于应激前(P＜0.05), 且0.12%YPF-P组在应激24h和48h时显著高于对照组(P＜0.05)。各组IL-8相对表达量在应激48h时显著高于应激前(P＜0.05), 而0.08%和0.12%YPF-P组在应激24h和48h时均稍低于对照组, 但差异不显著(P＞0.05)。各组MHCⅡ相对表达量在应激48h时显著低于应激前(P＜0.05), 而添加YPF-P组在应激前后均显著高于对照组(P＜0.05)。

图3 热应激下玉屏风多糖合生元对草鱼肝脏相关基因表达的影响Fig. 3 Effect of Yu-Ping-Feng Polysaccharide synbiotics on liver related gene expression of grass carp under heat stress

3 讨论

3.1 玉屏风多糖合生元对热应激条件下草鱼血清免疫酶活力的影响

我们前期的研究表明玉屏风多糖可以提高水产动物体内抗氧化酶活力, 能够消除机体多余的自由基并抑制脂质过氧化[10,17,18]。而玉屏风多糖合生元有助于益生菌在肠道内的生长、繁殖和定植,从而改善机体肠道菌群平衡和提高其免疫力, 使用效果更佳[19]。ALT和AST为肝脏内两种转氨酶, 是判断肝细胞是否损伤的经典性指标, 其活性变化同时也可以反映鱼体的健康状况[20]。在本研究中, 热应激后草鱼血清ALT和AST活力在应激后呈升高趋势, 可能是由于鱼体肝脏细胞膜被破坏, 导致ALT和AST释放进入血液循环系统, 进而引起血清中这两种酶活性升高, 与Jeney等[21]报道的鲤受到环境胁迫后血清转氨酶活力变化呈上升趋势研究结果一致。邵彦翔等[22]、明建华等[15]和王晶晶等[23]的研究结果也都表明, 热应激会导致水产动物血清中ALT和AST活性升高。本研究结果表明, 试验组在应激前后均能够不同程度降低草鱼血清中ALT和AST活力, 而Ⅲ组ALT和AST活力热应激前后均显著降低, 这表明该浓度玉屏风多糖合生元具有较好的添加效果, 能减少热应激后草鱼肝细胞氧化损伤。

3.2 玉屏风多糖合生元对热应激条件下草鱼肝脏抗氧化功能的影响

热应激会使鱼体内自由基增多, 诱发氧化损伤[24]。鱼类肝脏中SOD、GSH-Px和GR等重要的抗氧化酶可以保护机体免受氧化损伤[25]。而MDA是机体产生氧化应激反应后产生的脂质过氧化产物之一,热应激后其含量会增加。这表明热应激会使鱼类产生大量氧化活性物, 导致鱼体发生剧烈的氧化应激反应。刘波等[26]研究发现, 在热应激后罗氏沼虾肝胰腺T-AOC、SOD、GSH-Px等抗氧化酶活力降低, 而MDA含量增加; 类似的结果在金鱼的研究中也有报道[27,28]。本研究发现草鱼肝脏中SOD、T-AOC、GSH-Px 和GR活力随着热应激时间的延长而呈现先升高后降低的趋势, 这可能是由于热应激时间过长导致产生的自由基数目过多, 严重超出鱼体本身的清除能力, 从而使草鱼的抗氧化功能受损。与对照组相比, 试验组的草鱼在热应激后肝脏中SOD、T-AOC、GSH-Px 和GR活力均有不同程度的提高, MDA呈降低趋势, 而Ⅲ组的抗氧化酶活力和MDA含量热应激前后有不同程度地高于或低于其他3组, 表明在饲料中添加适量的玉屏风多糖合生元可以提高鱼体抗氧化酶的活性, 缓解热应激后草鱼肝脏的氧化损伤。

3.3 玉屏风多糖合生元对热应激条件下草鱼肝脏基因表达的影响

Nrf2/ARE信号通路在激活后能够启动Ⅱ相解毒酶基因、下游抗氧化酶类基因和分子伴侣类基因等的表达[29]。Nrf2是Nrf2/ARE信号通路的转录因子[30],Keap1是Nrf2的抑制因子,Nrf2的表达上调可以提高建鲤肌肉中SOD1和GSH-PxmRNA的表达[22]。Nrf2/ARE信号通路抑制IL-8表达水平[31]。IL-8是一种促炎因子, 能够趋化和激活中性粒细胞,释放超氧化物和溶酶体酶, 促进中性粒细胞表面黏附分子的表达[32]。由试验结果可知, 草鱼在热应激48h后, 各组肝脏Nrf2、HSP70和IL-8的表达水平均显著高于应激前, 而抗氧化酶类基因(Cu/Zn-SOD、GSH-Px和GR)mRNA的表达水平均低于应激前, 而抗氧化酶类基因与其相应的抗氧化酶活性变化趋势相似, 这表明可能热应激会导致鱼体的炎症反应,从而增强Nrf2和HSP70的表达水平提高鱼体的抗氧化应激能力, 但Nrf2持续积累可能对抗氧化酶类基因的表达有一定的抑制作用, 这与之前的研究类似[33]。MHCⅡ能结合并呈递抗原给T淋巴细胞, 从而激发机体免疫反应[34]。在热应激6h后各组MHCⅡ均呈下降趋势, 这可能是由于持续的热应激使鱼体肝脏组织受损导致免疫功能下降。在本研究中, 与对照组相比, 添加YPF-P组均能不同程度地提高Nrf2、HSP70、MHCⅡ和抗氧化酶类基因的表达水平,降低Keap1和IL-8的表达水平。而Ⅲ组在应激前后这些基因分别达到较高或较低水平, 这可能是由于添加玉屏风多糖合生元能增强鱼体的抗氧化应激能力, 从而减少热应激后的肝脏组织损伤。以上结果表明在饲料中添加适量的玉屏风多糖合生元促进MHCⅡ的表达, 并能通过Nrf2/ARE信号通路促进草鱼肝脏抗氧化酶类基因和分子伴侣类基因的表达而抑制IL-8的表达。

4 结论

综合实验结果可知, 随着热应激时间的延长导致草鱼的血清和肝脏生化指标、相关基因表达量均产生了不同程度的变化, 说明热应激后草鱼产生了强烈的应激反应。而玉屏风多糖合生元对鱼体起到一定的保护作用, 有助于提高草鱼的抗氧化应激能力, 有效缓解肝脏氧化损伤, 具有较好的免疫调节作用。在本实验添加水平范围内, 饲料中添加0.12%的玉屏风多糖合生元的效果最好。