饲料中添加椭圆栅藻对异育银鲫中科5号越冬后抗病力的影响

许文婕 夏 雨, 朱晓鸣 韩 冬 刘昊昆 杨云霞 解绶启, , 高 宏 金俊琰

(1. 中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049;3. 中国科学院种子创新研究院, 北京 100101)

越冬期是鱼类养殖阶段中的一个关键时期[1],低温和食物缺乏等胁迫会造成鱼类代谢紊乱和免疫力下降。在越冬期间, 大口黑鲈(Micropterus salmoides)体重降低[2]。南亚野鲮(Labeo rohita)的非特异性免疫指标随着季节变化而变化, 且血浆髓过氧化物酶(MPO)活力在冬季显著低于其他季节[3]。低温和饥饿会抑制黄姑鱼(Nibea albiflora)生长并且导致肝脏抗氧化酶基因表达下调, 抗氧化相关酶活力下降, 影响其肝脏功能和免疫功能[4]。随着越冬期结束, 水温逐渐升高, 鱼体易受到致病菌的侵入最终导致死亡[4,5], 给水产养殖业带来巨大的经济损失[6]。因此, 探究鱼类在越冬期间的生理状态特别是抗病力具有重要的意义, 可为提高养殖鱼类越冬期存活率提供一定的理论依据。

藻类富含藻蓝蛋白、藻多糖和β胡萝卜素等物质, 有提高鱼类免疫力的作用[7—9]。 在饲料中添加螺旋藻可以提高异育银鲫中科3号的超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)、碱性磷酸酶(AKP)、总抗氧化能力(T-AOC)和白细胞吞噬活性[10]。金头鲷(Sparus aurataL.)摄食添加微绿球藻(Nannochloropsis gaditana)或四爿藻(Tetraselmis chuii)饲料后血清天然溶血性补体活性显著增强[11]。在机体感染病菌后, Toll样受体(TLR)信号通路在非特异性免疫过程中起重要作用, TLR信号通路主要分为髓样分化因子88(MyD88)依赖性和MyD88非依赖性通路[12]。MyD88和包含Toll/白介素1的接头蛋白(TIRAP)是MyD88依赖性通路中重要的适配器蛋白, 包含TIR结构域的IFN诱导连接蛋白(TRIF)是MyD88非依赖性通路中重要的适配器蛋白[13]。促炎因子白介素1β(IL1β)和肿瘤坏死因子α1(TNFα1)等在非特异性免疫中起重要作用[14,15]。抗炎因子如转化生长因子β(TGFβ)和白介素10(IL10)等, 主要起到抑制炎症反应的过度激活的作用[16,17]。已有研究报道异育银鲫中科3号摄食螺旋藻后脾脏中Toll样受体(TLR)信号通路相关基因包括TLR2、MyD88、TIRAP、IL1β、TNFα等表达量显著高于对照组, 因此螺旋藻粉可以通过TLR信号通路的介导和参与, 最终提高异育银鲫中科3号的免疫力[10]。

异育银鲫(Carassius gibelio)是中国重要的经济性鱼类之一, 2019年全国养殖产量近300万吨[18]。异育银鲫中科5号是利用银鲫独特的异精雌核生殖,以生长优势和隆背性状为选育指标, 培育出整入了团头鲂分子模块的子代, 对疱疹病毒具有较强抗性和耐受性, 并且肌间骨数量显著低于中科3号, 在2018年被国家原良种委员会鉴定认可为水产养殖新品种[19—22]。异育银鲫作为大宗淡水鱼, 在越冬期间面临低温的胁迫。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是异育银鲫养殖过程中常见的致病菌,会造成败血症甚至最终导致死亡[23]。椭圆栅藻(Scenedesmus ovalternusHSJ296)富含α-亚麻酸和其他营养物质[24], 并且可以提高越冬期异育银鲫中科3号的抗病力[25]。已有研究表明异育银鲫中科3号和中科5号在免疫力等方面有显著性差异[26]。因此,本研究的目的是探究在饲料中添加椭圆栅藻是否可以提高越冬期异育银鲫中科5号的免疫力和抗病力。在异育银鲫中科5号越冬前期投喂基础饲料或者添加4%椭圆栅藻的饲料, 并在越冬结束后用嗜水气单胞菌进行攻毒实验, 测定其生长、免疫力和抗病力等指标。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

基于实验室前期的研究结果, 在饲料中添加3.38%的螺旋藻可有效提高异育银鲫的生长性能和免疫力[10]。因此, 本实验配置两种等氮(32%)等脂(10%)的实验饲料, 分别含有0(DS0)或者4%(DS4)椭圆栅藻(Scenedesmus ovalternusHSJ296), 饲料配方如表 1所示。椭圆栅藻的发酵采用基础培养基(FeSO4·7H2O, 3 mg/L; K2HPO4, 0.3 g/L; MgSO4·7H2O, 0.3 g/L; KH2PO4, 0.7 g/L; 甘氨酸, 0.1 g/L; 维生素B1, 0.01 mg/L; 维生素A5, 1 mL/L), 氮源为2 g/L KNO3, 碳源为20 g/L葡萄糖。栅藻粉主要营养成分含量(干重): 蛋白质10.16%、脂肪7.10%、水分6.82%和灰分3.88%。所有原料过40目筛后充分混匀, 加水搅拌后用制粒机(SLR-150, 中国水产科学院渔业机械研究所)制粒, 70℃烘烤后4℃保存。

表1 饲料配方和化学组成(g/kg干重)Tab. 1 Ingredients and proximate composition of the experimental diets

1.2 实验鱼和实验管理

异育银鲫中科5号来自于中国科学院水生生物研究所官桥渔场, 首先将实验鱼转移进实验系统中,饲喂2周以适应养殖环境。实验开始前, 将实验鱼饥饿24h, 挑选规格均匀且健康的个体进行养殖实验。实验设计2个处理组, 每组3个平行, 随机选取25尾规格均匀且健康的实验鱼[初重(109.24±0.23) g]称重后放入每个水族缸中。投喂实验持续4周, 每天两次饱食投喂(9:00和15:00)。实验期间水温变化情况见图 1, 水体氨氮含量维持在＜0.1 mg/L, 溶氧＞6 mg/L, 余氯＜0.01 mg/L, 光照周期为12L∶12D(8:00—20:00光亮)。投喂实验周期为2017年12月30日至2018年1月26日, 在投喂实验结束后(2018年1月26日)所有处理组停止投喂至越冬期结束(2018年3月16日), 越冬期结束后对实验鱼进行攻毒实验。

图1 实验期间水温变化情况Fig. 1 Water temperatures during the experiment

1.3 攻毒实验

本实验使用嗜水气单胞菌进行攻毒实验, 首先将嗜水气单胞菌接种到脑心浸液肉汤(BHI)固体培养基中复苏生长后, 挑选单克隆接种到BHI液体培养基中于30℃下培养6h, 然后离心(3500×g, 10min)收集沉淀物, 用PBS冲洗3次后获得攻毒实验菌种。在正式实验之前, 先进行预实验, 确定本实验异育银鲫7d半致死嗜水气单胞菌浓度为1×109CFU/mL。

在越冬结束后, 每缸选取15尾异育银鲫通过腹腔注射嗜水气单胞菌(2.8×109CFU/mL, 0.2 mL/100g鱼体重)进行攻毒实验, 其中2尾鱼取样, 13尾鱼用于统计攻毒后异育银鲫的累计存活率, 计算公式如下:

存活率(%)=(存活鱼总数/起始鱼总数)×100%

1.4 样品采集

在越冬期结束后, 使用麻醉剂MS-222(60 mg/L,Sigma, USA)将实验鱼麻醉后称总重, 同时每缸取2尾鱼进行样品采集。注射嗜水气单胞菌10h后, 每缸取2尾鱼进行样品采集。用肝素钠抗凝剂润过的注射器从实验鱼尾部静脉采血, 将血液在4℃下3000×g离心10min(Eppendorf 5417R, Germany)得到上清液为血浆, 保存于-80℃冰箱中用于后续分析。在采血后, 将实验鱼解剖取头肾组织于液氮中速冻, 随后转入-80℃冰箱中保存, 用于总RNA 的提取。

1.5 样品分析

血浆抗氧化和免疫指标T-AOC、SOD、MPO、丙二醛(MDA)、免疫球蛋白M(IgM)和补体C3(C3)采用商品试剂盒进行测试(南京建成生物工程研究所, 中国南京)。

使用TRIzol(Invitrogen, USA)提取头肾组织的总RNA, 并通过1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific,USA)检测总RNA的完整性、浓度和质量。使用MMLV逆转录酶(Promega, USA)对RNA进行反转录,反转录体系20 μL。在罗氏 Light Cycle 480 II PCR仪(Roche, Germany)上进行实时荧光定量反应,测定目标基因的表达量, 以β-actin为内参基因[27],引物序列见表 2。实时荧光定量反应体系为6 μL:2 μL cDNA, 3 μL LightCycle®480 SYBR®Green ⅠMaster(Roche, Switzerland), 0.24 μL Primer forward,0.24 μL Primer reverse, 0.52 μL PCR water。反应条件为: 95℃, 5min; 45个循环的3步扩增(95℃, 10s;56或60℃, 30s; 72℃, 30s)。目标基因相对表达量计算公式如下:

表2 实时荧光定量引物Tab. 2 Primers used for qPCR

式中,E目标基因为目标基因的扩增效率,E内参基因为内参基因β-actin的扩增效率,Ct为临界循环数[28]。

1.6 数据分析

使用统计软件SPSS 25.0对实验数据进行统计分析, 数据以平均数±标准误表示。首先对实验数据进行方差齐性检验(Levene homogeneity of viarance test); 采用独立样本t检验(Independent-samplettest)比较对照组和栅藻组或者攻毒前和攻毒后数据的差异,P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 生长结果和攻毒后存活率

在投喂实验期间, 对照组和栅藻组平均每尾鱼的摄食总量分别为(10.98±0.48)和(10.56±0.16) g, 无显著性差异。如图 2所示, 异育银鲫中科5号在饲喂4周后的体重与越冬初期体重无显著性差异(P＞0.05), 但在越冬结束时体重显著降低(P＜0.05)。对照组和栅藻组实验鱼的体重在各个时间点无显著性差异(P＞0.05)。攻毒后累计存活率在两组间无显著性差异(图 3;P＞0.05)。

图2 异育银鲫中科5号越冬期间体重变化Fig. 2 Body weight of gibel carp var. CAS Ⅴ during overwintering

图3 异育银鲫中科5号攻毒72h累计存活率Fig. 3 The cumulative survival rate of gibel carp var. CAS Ⅴchallenged with Aeromonas hydrophila infection for 72h

2.2 血浆抗氧化和免疫指标

如图 4所示, 在对照组中, 攻毒显著降低了实验鱼血浆SOD活力和MDA、C3、IgM的含量(P＜0.05); 在栅藻组中, 攻毒后MPO活力升高, 但是C3、IgM含量显著降低(P＜0.05)。在攻毒前, 对照组的SOD的活力和IgM的含量显著高于栅藻组(P＜0.05); 在攻毒后, 对照组T-AOC的活力高于栅藻组, 但是MDA的含量显著低于栅藻组(P＜0.05)。

图4 异育银鲫中科5号在攻毒前和攻毒10h后血浆抗氧化和免疫指标变化Fig. 4 Changes in plasma antioxidant and immunological indices of gibel carp var. CAS Ⅴ pre and 10h post bacterial challenge

2.3 免疫相关基因和细胞因子相关基因表达

异育银鲫中科5号在攻毒前后头肾中TLR通路相关基因表达变化见图 5。在对照组中, 攻毒后头肾中MyD88和IκBα基因表达量上调(P＜0.05); 栅藻组, 攻毒会引起TLR4、MyD88、TIRAP、TRIF和IκBα基因表达量上升(P＜0.05)。攻毒前, 各处理间基因表达量无显著性差异(P＞0.05)。攻毒后, 栅藻组实验鱼头肾中MyD88基因表达量显著高于对照组(P＜0.05)。

图5 异育银鲫中科5号在攻毒前和攻毒10h后头肾中TLR通路相关基因表达Fig. 5 The expression of TLR signaling pathway-related genes in the head kidney of gibel carp var. CAS Ⅴ pre and 10h post bacterial challenge

如图 6所示, 在攻毒后对照组实验鱼头肾中IL1β、TNFα1和IL10基因表达量上调(P＜0.05); 攻毒会引起栅藻组IL1β、TNFα1、IL10和TGFβ基因表达量上升(P＜0.05)。两个处理间基因表达量在攻毒前无显著性差异(P＞0.05)。在攻毒后, 摄食栅藻饲料的异育银鲫中科5号头肾中IL1β基因表达量显著高于对照组(P＜0.05)。

图6 异育银鲫中科5号在攻毒前和攻毒10h后头肾中细胞因子基因表达Fig. 6 Expression of cytokine genes in the head kidney of gibel carp var. CAS Ⅴ pre and 10h post bacterial challenge

3 讨论

在本实验中, 生长结果显示越冬结束时实验鱼体重显著下降。已有文献报道, 越冬会降低鱼体重,主要是因为饥饿和低温胁迫造成的[2]。摄食对照饲料和栅藻饲料的中科5号攻毒后的累计存活率无显著性差异。但是在异育银鲫中科3号的研究结果表明栅藻可以提高实验鱼在越冬后攻毒后累计存活率[25]。本实验选择的研究对象是异育银鲫中科5号,已有文献报道证明中科3号和中科5号在代谢和免疫等方面有显著差异[26], 因此, 栅藻对越冬期不同品系异育银鲫免疫力和抗病力的影响存在差异, 具体机制有待进一步的分析。

3.1 饲料中添加椭圆栅藻对血浆抗氧化和免疫指标的影响

血浆中抗氧化能力和细胞因子含量等被认为是衡量鱼类健康的重要指标[29]。低温会诱导机体产生活性氧继而激活抗氧化系统[4,30]。T-AOC和SOD可以清除代谢过程产生的自由基等物质, 而MDA是衡量鱼体氧化应激状态和脂质过氧化状态的重要指标[31—33]。本研究显示, 攻毒前对照组SOD活力高于栅藻组, 攻毒后对照组T-AOC活力高于栅藻组, MDA含量低于栅藻组。因为低温和攻毒会诱导机体产生自由基等有害物质, 进而抗氧化酶活力会升高去清除自由基[4,30], 栅藻饲料可能具有保护作用, 因此自由基物质产生量低于对照组,最终导致抗氧化酶活力较低。栅藻组的T-AOC活力、SOD活力和MDA含量在攻毒前后无显著性差异, 可能是摄食栅藻饲料的中科5号抗氧化系统对嗜水气单胞菌的响应较对照组缓慢。摄食栅藻饲料的中科3号血浆SOD活力和MDA含量在攻毒后也没有显著变化[25]。

MPO在机体先天免疫防御中起重要作用, 是中性粒细胞活化的标志, 并且会产生活性中间产物,具有强氧化性, 可以杀灭微生物[34,35]。在本研究中,MPO活力在不同饲料处理中无显著性差异, 但是栅藻组在攻毒后MPO活力显著升高。抗病力(嗜水气单胞菌)较强的南亚野鲮(Labeo rohita)品系MPO活力高于易感品系, 说明MPO可能在抵抗嗜水气单胞菌过程中起重要作用[36]。尽管摄食栅藻饲料后并没有提高中科5号攻毒后的存活率, 但是显著增强的MPO活力表明栅藻一定程度提高了中科5号的免疫力。已有文献报道, 鱼类摄食含有类胡萝卜素或者其他免疫增强剂可以增强MPO活力[37]。中科3号摄食栅藻饲料后血浆MPO活力同样在攻毒后显著升高, 并且高于对照组[25]。

补体系统在先天免疫系统中起重要的作用, 而补体C3是补体系统中重要的组成部分[38]。IgM是鱼类调节获得性免疫中关键的物质[39], 已有研究报道急性和慢性的冷应激都会造成肉鸡IgM表达量的升高[40]。在投喂实验结束后, 实验鱼保持饥饿状态至越冬期结束, 越冬结束后(即攻毒前)对照组中科5号血浆IgM含量显著高于栅藻组, IgM含量的升高可能是越冬期的低温应激造成的。因此, 栅藻可能在一定程度上缓解了冷应激对鱼体造成的影响。稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)在荧光假单胞菌攻毒后C3和IgM的含量显著降低[41]。与攻毒前相比, 攻毒后中科5号血浆C3含量和IgM含量显著降低, 可能与机体免疫力被抑制, 从而导致机体抵抗细菌感染的能力下降有关[42]。

3.2 饲料中添加椭圆栅藻对TLR通路相关基因表达的影响

TLR是鱼类先天免疫中重要的组成部分, 特别在抵抗病原体的过程中起重要的作用。TLR2、TLR3和TLR4是Toll样受体家族中主要的成员[43]。Toll样受体家族识别病原体关联分子, 并通过MyD88依赖性或者MyD88非依赖性通路转化为信号。TIRAP可以激活下游MyD88依赖性通路, 并且通过TLR2和TLR4调节MyD88依赖性通路[44]。TLR3和TLR4 通过TRIF激活MyD88非依赖性通路[45]。已有文献报道, 细菌感染会显著上调机体TLR信号通路相关基因表达, 包括TLR2、TLR3、TLR4、MyD88、TIRAP和TRIF等基因[10,46]。本实验结果显示嗜水气单胞菌攻毒后中科5号头肾中MyD88基因表达显著升高, 且栅藻组高于对照组。此外, 摄食栅藻饲料的中科5号的TLR4、TIRAP和TRIF基因表达也显著升高, 而对照组中无显著性变化。因此, 中科5号摄食栅藻后MyD88依赖性或者MyD88非依赖性通路可能都被激活以抵御病菌的入侵。尽管本实验中两个处理组的中科5号攻毒后累计存活率无显著性差异, 但是前期的实验证明在饲料中添加螺旋藻可以部分通过增强TLR通路相关基因表达从而有效提高异育银鲫3号存活率[10]。因此, 在饲料中添加栅藻可能在一定程度上提高中科5号越冬后的抗病力。NF-κB是调节先天性和特异性免疫应答的主要转录因子, 在炎症反应过程中TLR信号通过激活核因子κB(NF-κB)的抑制蛋白从而调控NF-κB介导的转录[47]。在本实验中, 中科5号IκBα基因表达量在攻毒后显著升高, 表明嗜水气单胞菌会诱导异育银鲫的炎症反应, 与中科3号的研究结果趋势相同[25]。

TLR信号通路的激发会诱导IL1β和TNFα1基因表达上调[48]。IL1β是一种促炎因子, 并且是机体应对组织损伤、细菌感染等过程的关键物质[14]。TNFα也是一种重要的促炎因子, 主要是通过激活内皮细胞进行调节的[15]。在本实验中, 中科5号头肾中IL1β和TNFα1基因表达在攻毒后显著高于攻毒前, 前期的实验也有相似的结果[10]。同时, 本实验结果显示摄食栅藻饲料的中科5号在攻毒后IL1β表达量显著高于对照组。已有研究证明, 一些饲料添加剂可以诱导IL1β基因表达。鲤摄食螺旋藻后IL1β基因表达量升高[49]; 在金头鲷的饲料中添加β葡聚糖会诱导头肾中IL1β的表达。因此, IL10和转化生长因子TGFβ是两种重要的抗炎因子[16,17]。在本实验中, 攻毒后, 摄食不同饲料中科5号头肾中IL10基因表达显著升高, 但是仅有栅藻组TGFβ表达量上调, 表明细菌感染会诱导头肾中抗炎因子的表达且在栅藻组中抗炎因子TGFβ反应更加灵敏。本实验结果显示, 攻毒后促炎因子和抑炎因子基因表达量同时增加, 与大口黑鲈的研究结果一致[50]。因为在细菌侵入鱼体后, 机体的免疫反应处于一个动态平衡的过程, 细菌会引起机体的炎症反应, 机体产生大量的促炎因子, 但是促炎因子也会通过增强凋亡和自噬等方式, 甚至促进机体产生抑炎因子来消除细菌带来的损伤[51]。

综上所述, 饲料中添加栅藻在一定程度上可以提高越冬后异育银鲫中科5号的抗病力, 这种调控可能是通过TLR通路来介导的。本研究为提高越冬后鱼类免疫力和抗病力提供一定的数据支撑。