粘质沙雷氏菌对重金属的耐受性和去除作用*

王 城，王玉洁,刘荣枝，薛常鲁

(嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江 嘉兴 314001)

重金属具有毒性、非生物降解性、持久性和生物累积性，当其超过环境最大处理容量时，是一种对生态环境和人体健康危害极大的污染物[1-2]。浙江省以印染、皮革等行业为支柱产业，印染和皮革废水中重金属含量严重超标，是环境保护规划和整治的重点对象。

治理重金属污染的方法有：物理修复法(包括吸附法、液膜法、电渗析法等)、化学修复法(包括化学沉淀法、氧化还原法、离子交换法等)、生物修复法等[3]。传统的物理和化学修复法存在着成本大、能耗高、二次污染等不足[3-4]。生物修复法自20世纪90年代以来，因为其投资小、运行费用低、对环境友好等优点而备受关注[5]。微生物修复相对于其他生物，具有实施方便、高效、资源丰富等优点，成为环境重金属污染修复新技术探索中的热点之一[4-5]。陈亚奎等[6]发现粘质沙雷氏菌HB-4对水体中Cd2+具有高吸附性和高耐受性，该菌株能在 Cd2+浓度为 300 mg/L时正常生长，对 Cd2+的去除率达到50%以上。李同灵等[7]筛选出一株埃希氏菌P15菌株最高耐Pb浓度达1200 mg/L。

目前利用微生物进行重金属修复的主要集中菌种资源的开发[7,9-10]和对重金属污染治理条件及机制[6,8,11-14]的实验室探索阶段。本课题组获得一株高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescensjx-1)，在前期研究的基础上已发现该菌具有良好的抑菌、抑藻生物活性[16-17]。本研究旨在探讨该菌株对Cu2+、Zn2+、Cr6+三种重金属的耐受性和去除效果，从而为开发高效节能的微生物重金属治理方法提供基础。

1 实验材料

1.1 菌 种

粘质沙雷氏菌 (Serratiamarcescensjx-1)，实验室保藏。

1.2 试 剂

铜标准液(1 mg/mL)，锌标准液(1 mg/mL)，铬标准液(1 mg/mL)，CuSO4·5H2O(AR)，ZnSO4·7H2O(AR)，K2Cr2O7(AR)。

1.3 培养基

LB培养基：胰蛋白胨5.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，葡萄糖1.0 g/L，pH 7.2。

液体培养基：蛋白胨13 g/L，甘油20 g/L，MgSO41.2 g/L，NaCl 5.0 g/L，甘氨酸2.0 g/L，pH 7.2。

1.4 仪 器

710-ES电感耦合等离子发射光谱仪，Varian公司；UV-1801紫外分光光度计，北分瑞利公司；VS-130超净台，苏州安泰；HD-930恒温震荡培养箱，上海隆拓仪器设备有限公司。

2 实验方法

2.1 菌种活化

将从-70 ℃保存的菌种转接于LB平板上培养12 h，挑选单菌落接种于液体LB培养基，37 ℃、200 rpm/min培养12 h获得种子液，控制种子液密度在OD600为0.8左右。

2.2 S.marcescens jx-1对重金属Cu2+的耐受性研究

配置5 g/L的CuSO4母液，调节液体发酵培养基中Cu2+的浓度梯度为0、50、100、150、200 mg/L，接种后分别在37 ℃和28 ℃下，200 r/min培养60 h，每隔12 h取样测OD600，考察S.marcescensjx-1在不产灵菌红素(37 ℃培养)和产灵菌红素时(28 ℃培养)对不同浓度重金属Cu2+的耐受性。

(1)

2.3 S.marcescens jx-1对重金属Zn2+的耐受性研究

配置5 g/L的ZnSO4母液，设置发酵液中Zn2+浓度梯度为0、50、100、150、200 mg/L，按照2.2实验方法考察S.marcescensjx-1对重金属Zn2+的耐受性。

2.4 S.marcescens jx-1对单一重金属的耐受性研究

配置5 g/L的K2Cr2O7母液，设置发酵液中Zn2+浓度梯度为0、50、100、150、200 mg/L，按照2.2实验方法考察S.marcescensjx-1对重金属Cr6+的耐受性。

2.5 S.marcescens jx-1对重金属的去除作用

根据2.2、2.3和2.4的实验结果，设置液体培养基中Zn2+、Cu2+、Cr6+的浓度分别为250 mg/L、100 mg/L、100 mg/L，接种后在28 ℃，200 r/min培养60 h，每隔12 h取样，经离心过滤后电感耦合等离子发射光谱方法测定重金属的含量，计算重金属的去除率，考察S.marcescensjx-1对不同重金属的去除效果。

去除率 =(C0-Ce)/C0×100%

(2)

式中：C0为空白组的重金属含量；Ce为实验组的重金属含量。

3 结果与讨论

3.1 S.marcescens jx-1对重金属Cu2+的耐受性

根据2.2实验方法，分别考察37 ℃(不产灵菌红素)和28 ℃(产灵菌红素)条件下，不同浓度的Cu2+对S.marcescensjx-1生长的影响，结果如图1和图2所示。

图1 37 ℃时Cu2+对S.marcescens jx-1生长影响Fig.1 The effect of Cu2+ to S.marcescens jx-1 at 37 ℃

图2 28 ℃时Cu2+对S.marcescens jx-1生长影响Fig.2 The effect of Cu2+ to S.marcescens jx-1 at 28 ℃

由图1可知，在37 ℃振荡培养时，S.marcescensjx-1不产生灵菌红素，菌体产量较低，Cu2+为50 mg/L时对菌体有明显抑制，培养24 h时抑制率为43.3%，Cu2+为150 mg/L时表现出基本完全抑制，S.marcescensjx-1对Cu2+最高耐受浓度为100～150 mg/L。由图2可知，在28 ℃振荡培养时，S.marcescensjx-1产生灵菌红素，菌体产量较高，Cu2+为50 mg/L时基本没明显抑制，培养24 h时抑制率仅为2.6%，Cu2+为100 mg/L时对菌体有明显抑制，培养24 h时抑制率为63.4%，Cu2+为200 mg/L时表现出完全抑制，S.marcescensjx-1对Cu2+最高耐受浓度为150～200 mg/L。

3.2 S.marcescens jx-1对重金属Zn2+的耐受性

根据2.3实验方法，分别考察37 ℃(不产灵菌红素)和28 ℃(产灵菌红素)条件下，不同浓度的Zn2+对S.marcescensjx-1生长的影响，结果如图3和图4所示。

图3 37 ℃时Zn2+对S.marcescens jx-1生长影响Fig.3 The effect of Zn2+to S.marcescens jx-1 at 37 ℃

图4 28 ℃时Zn2+对S.marcescens jx-1生长影响Fig.4 The effect of Zn2+to S.marcescens jx-1 at 28 ℃

由图3可知，不产生灵菌红素，在0～100 mg/L范围内，Zn2+对菌体生长无明显影响；Zn2+在150 mg/L时对菌体有明显抑制，培养24 h时抑制率为53%，250 mg/L时接近完全抑制，S.marcescensjx-1对Zn2+最高耐受浓度为200～250 mg/L。由图4可知，产生灵菌红素时，在0～100 mg/L范围内，培养24 h时Zn2+对菌体生长有一定促进作用；Zn2+为100～250 mg/L时，对菌体有一定抑制，在250 mg/L时培养24 h，对S.marcescensjx-1抑制率为21.4%；从生长曲线上来看，抑制主要体现在延滞期延长和稳定期菌体最高产量降低；在本实验设置的梯度范围内，S.marcescensjx-1没有出现完全抑制的生长状态，表现出对Zn2+较高的耐受性。

3.3 S.marcescens jx-1对重金属Cr6+的耐受性

根据2.4实验方法，分别考察37℃(不产灵菌红素)和28 ℃(产灵菌红素)条件下，不同浓度的Cr6+对S.marcescensjx-1生长的影响，结果如图5和图6所示。

图5 37 ℃时Cr6+对S.marcescens jx-1生长影响Fig.5 The effect of Cr6+to S.marcescens jx-1 at 37 ℃

图6 28 ℃时Cr6+对S.marcescens jx-1生长影响Fig.6 The effect of Cr6+to S.marcescens jx-1 at 28 ℃

由图5可知，不产生灵菌红素时，50 mg/LCr6+对菌体表现出明显抑制，培养24 h时抑制率为52.1%，100 mg/L时完全抑制，S.marcescensjx-1对Cr6+最高耐受浓度为50～100 mg/L。由图6可知，产灵菌红素时，Cr6+为50 mg/L时，对S.marcescensjx-1表现出一定抑制，培养24 h时抑制率为20.2%，Cr6+为100 mg/L时培养24 h抑制率达到65.4%，最高的耐受浓度在150～200 mg/L，与伍迪等[15]相比，耐受性更强。

3.4 S.marcescens jx-1对重金属的去除作用

根据实验方法2.5，对发酵液中剩余重金属含量进行测定，考察S.marcescenjx-1对重金属的去除作用，结果如图7所示。

图7 S.marcescens jx-1对重金属的去除作用Fig.7 The removal effect of S.marcescens jx-1 to heavy metal

由图7可知，S.marcescensjx-1对三种重金属的去除效果表现为 Zn2+>Cr6+>Cu2+，48 h内的最大去除率分别为63.3%、44.5%、32.3%，这与耐受性实验结果Zn2+> Cu2+>Cr6+不完全一致。从3.1～3.3实验结果可知，相较于100 mg/L的Cr6+和Cu2+，菌体对250 mg/LZn2+的耐受性最好，菌体生长性能最佳，通过吸附、络合、主动吸收等机制[3,15]达到去除Zn2+的效果也相对最好，24 h内达到最大去除率63.3%。100 mg/L的Cr6+和Cu2+对菌体生长的抑制较为接近，24 h的抑菌率分别为63.4%和65.4%， Cr6+的去除率高于Cu2+，这可能与菌体去除重金属的机制有关。有研究表明，Cr6+能通过与粘质沙雷氏菌的胞外代谢产物灵菌红素发生粘连而去除发酵液中的Cr6+[13]，细菌对Cu2+的去除一般通过静电引力和代谢吸收[15]为主，去除率会受到菌体表面带的负电荷量和代谢效率的影响。

4 结 论

(1)S.marcescensjx-1对Cu2+、Zn2+、Cr6+具有良好的耐受性，耐受性表现为Zn2+> Cu2+>Cr6+。不产灵菌红素时，Cu2+、Zn2+、Cr6+最大耐受浓度分别为100～150 mg/L、200～250 mg/L、50～100 mg/L；产灵菌红素时，Cu2+、Zn2+、Cr6+最大耐受浓度分别为150～200 mg/L、>250 mg/L、150～200 mg/L。

(2)S.marcescensjx-1的代谢产物灵菌红素，有助于增加菌体对重金属的耐受性。首先S.marcescensjx-1在28 ℃培养时，灵菌红素合成酶基因得到表达，产生灵菌红素，对菌体的生长性能有促进作用，菌体最高产量比37 ℃培养时提高200%左右，菌体细胞密度增加，每个菌细胞受到的重金属损伤程度降低，因此菌体细胞表现出更高的耐受性。其次，有研究表明粘质沙雷氏菌的次级代谢产物灵菌红素能通过络合重金属来减少重金属对菌体的伤害，从而提高菌体的耐受性[13]，具体机制有待进一步探究。

(3)S.marcescensjx-1对三种重金属的去除效果表现为 Zn2+>Cr6+> Cu2+，与耐受性实验结果不完全一致，可能与菌体的吸附机制有关，48 h内的最大去除率分别为63.3%、44.5%、32.3%。