MALDI-TOF MS在高原地区用于CRE同源性分析的初步研究*

何轶群，黄文辉，李 娟，赵玲莉，张 翔，杨世闻

青海大学附属医院检验科，青海西宁 810001

近年来耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)引起的院内和社区感染越来越多，其病死率也越来越高。CRE引起的感染在临床治疗上不仅不好治愈而且病死率较高[1-2]。CRE可通过患者与患者、患者与医护人员之间进行相互传播，不仅严重威胁患者的生命健康，而且造成医疗资源的浪费和患者经济负担的加重。及时对院内CRE进行同源性分析，是判断其是否存在院内感染及确定传染源的关键。目前用于细菌同源性分析的方法多采用多位点序列分型(MLST)方法。MLST的优点是重复性好，分辨力高，易于标准化，并可直接进行分析[3-4]，缺点是要提前知道待测菌株基因组序列，并查询该菌株相对应的管家基因。此外检测的高额费用和所需特定的仪器使得MLST只能局限在大型的流行病学研究中心，不适用于医院等中小范围的流行病学分析。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是近年来快速发展起来的一种新型微生物鉴定技术，自2010年质谱技术进入国内后得到了飞速发展[5-8]。MALDI-TOF MS主要是分析比较细菌的蛋白质指纹图谱，其最大特点是快速、简单、方便，可在几分钟内完成病原菌的同源性分析[9-10]。本研究通过对青海大学附属医院重症医学科分离的5株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌，以及同期其他科室分离的6株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌进行MALDI-TOF MS和MLST同源性分析，通过比较评价MALDI-TOF MS在高原地区用于CRE同源性分析的能力，从而为高原地区医院感控工作提供一种快速、便捷、经济的同源性分析方法。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源 收集青海大学附属医院2020年1月分离的肺炎克雷伯菌，其中5株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌来自重症医学科，碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌采用金山川免疫显色表型检测卡进行确认，经确认均为KPC酶型的CRE，6株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌来自其他科室。肺炎克雷伯菌ATCC10031由本实验室保存。

1.1.2培养基 实验所用的血琼脂平板来自赛默飞世尔生物化学制品(北京)公司有限公司。

1.2仪器与试剂 甲酸、HCCA基质、三氟乙酸、乙腈购于德国布鲁克公司，PCR实验所需试剂全部购于上海生工生物工程有限公司。MALDI-TOF MS(德国布鲁克)，PCR扩增仪(美国Bio-rad)，ViteK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏系统(法国梅里埃)，凝胶成像仪(美国Bio-rad)，电泳仪(北京六一)。

1.3方法

1.3.1MLST 将保存于-20 ℃冰箱的菌株冻存管中的待测肺炎克雷伯菌转种于血琼脂平板上，35 ℃培养24 h后备用。采用煮沸法提取细菌基因组，具体步骤：无菌挑取备用菌株于400 μL的无菌蒸馏水中煮沸10 min，13 000 r/min离心5 min，取上清液做细菌模板DNA。肺炎克雷伯菌7对管家基因gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB，参考MLST网址https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html中提供的方法进行扩增，扩增序列上传MLST网站进行比对，得到相应的细菌ST型，具体引物长度、退火温度和PCR产物扩增长度见表1。

表1 肺炎克雷伯菌7对管家基因序列

1.3.2MALDI-TOF MS同源性分析 将保存于-20 ℃冰箱的菌株冻存管中的肺炎克雷伯菌转种于血琼脂平板上，35 ℃培养24 h后备用。采用甲酸提取法进行菌株处理，用10 μL的一次性接种环挑取待测菌株于1.5 mL的小型离心管中，加入300 μL的去离子水，取待测菌株至小型离心管中，用移液枪反复吹打，加入900 μL的无水乙醇充分混匀，13 000 r/min离心2 min，用移液枪弃上清液，整个过程不应触碰沉淀。室温下干燥沉淀2～3 min，向小型离心管中加入50 μL的70%的甲酸和50 μL的乙腈充分混匀后以13 000 r/min离心2 min，取1 μL的上清液于MALDI靶板上，晾干后再加1 μL的HCCA基质晾干后备用。应用MALDI-TOF MS软件中的MALDI Biotyper RTC软件进行数据采集。通过MALDI-TOF MS中的flexAnalysis获取蛋白峰信息采集，通过MALDI Biotyper 3软件进行聚类分析和主成分分析。

2 结 果

2.1MLST分析结果 分析显示来自重症医学科的5株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌均为ST11型，来自其他科室的6株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌中3株为ST147型，2株为ST340型，1株为ST1724型。

2.2MALDI-TOF MS同源性分析结果 应用分析软件MALDI Biotyper3 对11株肺炎克雷伯菌进行聚类分析，结果见图1，聚类分析后发现MALDI-TOF MS将11株肺炎克雷伯菌分为两大类，来自重症医学科的5株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌被划分为Ⅰ类，来自其他科室的6株肺炎克雷伯菌被划分为Ⅱ类。5株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌蛋白质谱见图2，可以看出来自重症医学科的5株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌的蛋白峰大致一样，并且和肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC10031的某些蛋白峰有明显差异。主成分三维散点分析见图3，可以看出11株肺炎克雷伯菌处于两个平面，其中1～5号为来自重症医学科的5株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌，三维散点图显示均处于同一个平面且空间距离较近，来自其他科室的6株肺炎克雷伯菌处于其他平面，结果提示5株来自重症医学科的碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌空间较近，推断亲缘关系较近，可能为同一株来源。

注：1～5号为来自重症医学科的碳青霉烯耐药的5株肺炎克雷伯菌，6～11号为来自其他科室的碳青霉烯敏感的6株肺炎克雷伯菌。图1 11株肺炎克雷伯菌MALDI-MOF MS同源性分析图

注：kpn1～kpn5为5株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌，kpn6为肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC10031。图2 5株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌和肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC10031的蛋白质谱图

注：1～5号为来自重症医学科的碳青霉烯耐药的5株肺炎克雷伯菌，6～11号为来自其他科室的6株肺炎克雷伯菌，PC1为第一主成分，PC2为第二主成分，PC3为第三主成分，Load1为载荷1，Load2为载荷2，Load3为载荷3。图3 11株肺炎克雷伯菌的主成分三维散点图

3 讨 论

目前高原地区应用MALDI-TOF MS技术进行CRE同源性分析的研究报道较少。本研究采用MLST和MALDI-TOF MS技术对待测菌株进行同源性分析。MLST分析结果显示，5株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌均为ST11型，6株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌中3株为ST147型，2株为ST340型，1株为ST1724型。MALDI-TOF MS将11株肺炎克雷伯菌分为两大类，其中来自重症医学科的5株为Ⅰ类，来自其他科室的6株为Ⅱ类，两种方法在同源性分析方面的结果基本一致。来自重症医学科的5株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌中，其中3株来自不同患者的肺泡灌洗液，1株来自患者所处环境，1株来自呼吸机，同源性分析将其归为同一类，提示可能是由于院内消毒不彻底引起的院内暴发，后期的流行病学调查也提示为院内感染。通过后期询问临床得知，3例患者中2例死亡，1例患者病情严重家属放弃治疗后自动出院，这也提示在今后的工作中要重视CRE引起的院内交叉感染。

CRE引起的院内感染暴发在国内外已有很多报道，快速对CRE进行同源性分析是控制CRE院内感控的重要手段。李冬菊等[11]应用MALDI-TOF MS技术对重症ICU病房的怀疑院内感染暴发的7株肺炎克雷伯菌进行研究，结果发现MALDI-TOF MS技术在同源性分析方面可以和MLST分型相媲美，这也和本研究结果一致。国外有学者通过大量的研究得出MALDI-TOF MS在病原菌同源性分析方面的准确度与MLST相类似[12-14]。但是应用MLST进行同源性分析需要高额费用和特定仪器，以及进行PCR扩增后外送测序，使其只能局限在大型的流行病学研究中心，不适用于医院中小范围及高原地区进行同源性和流行病学分析。

虽然本研究发现在高原地区MALDI-TOF MS在同源性研究方面和MLST分型结果一致，但徐建民等[15]应用MALDI-TOF MS技术分析95株肺炎克雷伯菌后得出，该方法虽然能比较直观清晰的分析细菌的同源性，但是其广泛应用于临床菌株同源性分析方面还需要更深入的实验研究。MALDI-TOF MS主要是通过分析细菌蛋白质表达的特征峰，而菌体蛋白表达可能会受到温度、海拔、培养条件等影响，导致两种方法在同源性分析方面还有差距。

全国细菌耐药监测网数据显示，我国CRE检出率逐年呈现上升趋势，其引起的病死率也在逐年增加[1]。GUDUCUOGLU等[16]对某大学医院两个重症ICU病房8例患者连续分离出的9株耐碳青霉烯类抗菌药物耐药的肺炎克雷伯菌进行调查，发现5例患者平均于12 d内因感染死亡，病死率高达62.5%。CRE引起的感染因治疗手段有限，在治疗上不仅难治而且病死率高，只能采取隔离和消毒等措施[17-20]。青藏高原地区处我国西北，经济和医疗条件相对落后，一旦发生院内CRE感染其后果相对严重，故对高原地区疑似发生院内感染暴发的CRE快速进行同源性分析，可为院内CRE感控提供数据支持。MALDI-TOF MS因其快速、方便、经济的特点，故在同源性分析方面有一定的潜力，尤其对笔者所在的高原地区的医院有一定的应用推广价值，但需要在今后的研究中加大菌株数量及不同菌种之间的比较，从而更好更快地为院内感控工作服务。