肺泡灌洗液中多种生物标志物的联合检测在呼吸机相关性肺炎早期诊断中的应用*

谭家余，麦志伟，杨 博，钟苑芳，李景姗，罗正超，黄 湘

1.南方医科大学附属中山市博爱医院重症监护室，广东中山 528403；2.广东省佛山市妇幼保健院检验科，广东佛山 528200

肺泡灌洗液(BALF)中生物标志物可能有助于各种感染疾病的早期诊断，包括呼吸机相关性肺炎(VAP)。但大多数研究的生物标志物是炎症标志物，缺乏特异性。近年来，研究表明与VAP有关的生物标志物较多，如巨噬细胞炎症蛋白-1α、白细胞介素-1β、粒细胞集落刺激因子、可溶性髓系细胞触发受体-1(sTREM-1)、联啡肽、纤溶酶原激活抑制物-1、穿透素-3(PTX3)、表面活性蛋白D(SP-D)等[1-4]。本课题组既往研究显示中性粒细胞弹性蛋白酶可作为诊断VAP的指标之一，且与VAP的转归有关[5]。但目前仍缺乏单一的确诊VAP的生物标志物。为此，本研究拟通过联合检测BALF中降钙素原(PCT)、C-反应蛋白(CRP)、sTREM-1、PTX3和SPD等指标，来探讨多个生物标志物联合检测在诊断VAP中的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年5月至2021年4月在中山市博爱医院重症监护室进行机械通气治疗的患者587例。纳入标准：年龄≥14岁；特重型颅脑损伤、脑出血、脑梗死、急性左心衰竭、心脏骤停、重度哮喘、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、重症胰腺炎等需要呼吸机支持的患者。排除标准：社区性肺炎、免疫系统疾病、肺部恶性肿瘤、肺结核和血液病等；通气时间<48 h；中途非VAP死亡；放弃治疗；临床资料不全者。VAP的诊断标准参照《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南(2018年版)》[6]相关标准。VAP患者46例，剔除符合排除标准，中途非VAP死亡和临床资料不全的患者，VAP组入组40例，同期非VAP组入组48例。本研究经该院医学伦理委员会批准。

1.2方法 BLAF采集方法：用纤支镜把气道内痰吸尽，纤支镜远端送入段支气管开口处，注入生理盐水10 mL，随后负压吸引，将BLAF吸到无菌集痰器内。以1 500 r/min离心5 min，取上清液保存在-80 ℃超低温冰箱内待测。在上机时、确诊VAP时和脱机时各采集BLAF 1次。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中CRP、sTREM-1、PTX3、SP-D水平，试剂盒由武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司提供，采用罗氏电化学发光法检测PCT水平，试剂盒由罗氏诊断产品(上海)有限公司提供，具体步骤按试剂盒操作说明书进行。

收集患者临床资料，如年龄、性别、体温、痰量、氧合指标、痰细菌培养、机械通气时间、影像学结果和急性生理学和慢性健康状况评价(APACHE)Ⅱ评分等。

2 结 果

2.1两组一般资料比较 两组的年龄、性别、APACHEⅡ评分及病种分类等指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2两组生物标志物水平比较 两组患者上机时BALF中生物标志物水平(PCT、CRP、sTREM-1、PTX3)均较低，但组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)；与上机时比较，确诊VAP时非VAP组BALF中PTX3水平升高(P<0.05)，但其他生物标志物水平变化均不明显(P>0.05)，而VAP组BALF中生物标志物水平均明显升高(P<0.05)；确诊VAP时，两组PCT、sTREM-1、SP-D、PTX3水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与确诊VAP时比较，VAP组脱机时BALF中生物标志物水平均明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 两组生物标志物水平比较[M(P25，P75)]

组别nsTREM-1(ng/mL)上机时确诊VAP时脱机时SP-D(pg/mL)上机时确诊VAP时脱机时非VAP组486.33(0.25,17.93)7.81(0.25,25.49)5.44(1.44,13.38)0.16(0.01,0.33)0.16(0.01,0.45)0.12(0.04,0.33)VAP组405.54(3.02,18.79)26.43(5.78,48.00)a9.09(3.85,20.00)b0.22(0.09,0.56)0.52(0.22,1.33)a0.22(0.09,0.56)bZ-0.630-3.178-1.888-2.261-4.221-1.953P0.5280.0010.0590.024<0.0010.051

组别nPTX3(pg/mL)上机时确诊VAP时脱机时非VAP组4836.02(16.59,71.44)54.50(19.40,208.40)a43.55(19.40,74.50)bVAP组4037.13(12.51,60.27)408.69(193.09,646.50)a40.52(17.42,76.02)bZ-0.855-4.894-0.314P0.393<0.0010.753

2.3各生物标志物诊断VAP的价值分析 结果发现BALF中除CRP(AUC为0.546，灵敏度为0.36，特异度为0.80)外，PCT、SP-D、sTREM-1、PTX3诊断VAP均有较高的诊断价值，AUC分别为0.803、0.762、0.697、0.804，灵敏度分别为0.75、0.78、0.76、0.81，特异度分别为0.78、0.60、0.58、0.60；对BALF中诊断VAP有意义的4个生物标志物(PTX3、PCT、SP-D、sTREM-1)按AUC由大到小进行联合检测，发现不同组合的AUC均在0.8以上，说明联合检测能够增加诊断VAP的准确性，其中PTX3+PCT+SP-D的AUC最大，为0.868，PTX3+PCT的AUC为0.839，PTX3+PCT+SP-D+sTREM-1的AUC为0.863。见图1。

图1 BALF中PCT、SP-D、sTREM-1、PTX3单独及联合检测诊断VAP的ROC曲线

3 讨 论

VAP是重症监护室一种常见的与机械通气有关的肺部感染，它的发生会加重患者原有病情，影响患者预后，甚至导致病死率升高，同时也可延长患者住院时间，增加住院费用。如何早期诊断VAP，是VAP防治中的重中之重。如能早期发现，早期治疗，可减少治疗的成本，改善患者预后，同时减少抗菌药物的盲目使用。但由于VAP患者的临床症状和体征与其他重症患者相似，而目前尚缺乏快速理想的病原学诊断靶标，治疗主要依赖于经验用药。故寻找可诊断或判断VAP预后的生物学指标对于该病的及时治疗和改善预后意义重大。

众所周知，CRP是一个最常见的炎症指标，与感染性和非感染性疾病均有关，缺乏特异性。有研究显示，检测BALF中CRP对VAP的诊断具有一定帮助，特别是动态监测其变化可以用来评估疾病的进程[7]。本研究亦发现VAP组BLAF中CRP水平明显升高，但与非VAP组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。可能原因是BLAF中CRP要比血清中水平明显低，变化不明显，另外，CRP缺乏特异性，患者原发病也可能引起BLAF中CRP水平升高。PCT是一个很好的细菌性感染早期预测和疗效观察指标，有研究显示BALF中PCT诊断VAP的灵敏度为55%，特异度为80%，其水平随疾病的加重而升高、随疾病好转而降低[8]。但丁磊等[9]研究显示，在比较VAP组及非VAP组BALF中PCT和CRP水平时，未发现明显差异。本研究则发现，确诊VAP时，与非VAP组比较，VAP组BALF中PCT水平升高，而且VAP好转后，PCT水平明显降低(P<0.05)，与SHOKRI等[8]研究类似。但是本研究在检测BALF中PCT水平时，尽管采用了目前准确率比较高的罗氏电化学发光法，但所有患者检测出的水平均较低，呈非正态分布，而且数值变化幅度没有血清PCT明显，是否检测血清PCT诊确VAP准确性会更好，有待进一步研究。另外，本研究中BALF标本检测出的CRP和PCT水平均较低，是否与BALF中分泌不多有关，或者与标本保存时间过长蛋白质已经分解有关，值得进一步探讨。

sTREM-1是一种免疫球蛋白，在肺泡巨噬细胞中选择性表达。自GIBOT等[10]报道检测BLAF中sTREM-1水平可用于VAP的早期诊断以来，国内外学者相继进行了较多的研究，本课题组近期通过总结国内外公开发表的文献进行Meta分析得出了肺泡液中sTREM-1水平明显升高，可以作为VAP的早期诊断指标的结论[11]。PTX3也是一种急性时相反应蛋白，在早期炎症反应中发挥重要的调控作用。人体肺泡内皮细胞可以在促炎因子的作用下大量合成分泌，因此在VAP发生时BALF中可能检测到其明显变化。YE等[12]通过Meta分析发现BALF中PTX3诊断呼吸道感染的AUC为0.89，BALF中PTX3的检测有助于VAP的早期诊断。SP-D是一种丰富的肺表面活性剂相关蛋白，在肺的局部防御和免疫调节等过程中起重要作用。SAID等[3]发现儿科机械通气患儿BALF中SP-D水平明显升高，而且与不同菌种有关，其变化先于临床肺部感染评分和BALF培养检测到的感染。本研究发现与上机时比较，诊断VAP时VAP组BALF中生物标志物水平(SP-D、sTREM-1、PTX3)均明显升高(P<0.05)。与非VAP组比较，VAP组诊断VAP时SP-D、sTREM-1、PTX3水平均明显升高(P<0.05)，VAP临床治愈后上述标志物均明显降低(P<0.05)。同时研究也发现，上述3个标志物在不同患者BALF中变化巨大，均呈非正态分布，因此数据分析时采用的均是非参数检验，这也提示对这类指标研究最佳临界值时要慎重，不同的标本来源得出的最佳临界值可能相差很大。

通过绘制ROC曲线分析发现，BALF中除CRP外，PCT、SP-D、sTREM-1、PTX3诊断VAP，均有较好的准确性，AUC分别为0.803、0.762、0.697、0.804。进一步对上述4个生物标志物按AUC由大到小进行联合检测，发现不同组合的AUC均在0.8以上，其中PTX3+PCT+SP-D组合的AUC最大，为0.868。说明联合检测能够增加诊断VAP的准确性。但本研究的样本量仍较少，采集标本的时间过长，对结果有一定影响。下一步宜进行多中心研究，统一标本采集方法，缩短标本采集时间，增加样本量，以便得出更有意义的结论。

综上所述，本研究提示BALF中PCT、SP-D、sTREM-1、PTX3诊断VAP，均有较好的准确性，而上述4个指标的不同组合联合检测均能够进一步增加诊断VAP的准确性，其中PTX3+PCT+SP-D组合最有意义。