FTO在前列腺癌中的表达及其临床意义*

胡 萍，李 会，杨溪霖，张海宁，卿克勤

四川省成都市第一人民医院检验科，四川成都 610041

前列腺癌在西方发达国家是最常见的男性肿瘤，约占男性肿瘤的1/3，病死率位于男性肿瘤的第3位[1-2]。随着我国经济的快速发展、人口老龄化的加剧，前列腺癌的发病率逐年上升，成为老年男性健康的重要威胁。由于前列腺癌早期症状隐匿，且不同地区前列腺特异抗原筛查存在差异，在我国前列腺癌初诊患者人群中，高危患者占比较多[3-4]。目前，前列腺癌发生发展的分子机制仍然不是十分明确。因此，寻找前列腺癌发生发展过程中的关键因子，将为前列腺癌早期诊断、治疗及预后等提供理论基础和分子靶标。

肥胖相关蛋白(FTO)是一种位于染色体16q12.2上的N6-甲基腺苷去甲基酶[5]，除了与肥胖症的发病相关，越来越多的研究证实，FTO基因在乳腺癌、胃癌、急性髓细胞性白血病(AML)等多种肿瘤中均过表达，并且参与了多种肿瘤的发生、发展、侵袭和转移，是未来靶向治疗研究的重要热点[6-7]。

为了探索FTO基因与前列腺癌的关系，本研究首先采用免疫组织化学染色法检测前列腺癌癌组织和癌旁组织中FTO的表达；采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测FTO在前列腺正常细胞和癌细胞中的表达；采用统计学方法分析FTO的表达与前列腺癌组织临床病理特征的关系；采用Transwell实验检测FTO慢病毒干扰质粒感染前列腺癌细胞22RV1后的侵袭能力变化情况。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 前列腺癌癌细胞PC3、22RV1、Du145和Lncap，前列腺正常细胞RWPE均购自中国科学院细胞库；组织芯片购自上海芯超生物公司，包括3例前列腺正常组织，52例前列腺癌癌旁组织，55例前列腺癌组织，前列腺癌组织相关病理参数见表1；脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；FTO慢病毒干扰载体shRNA购自赛业生物公司。

表1 前列腺癌患者临床病理特征和前列腺癌FTO的表达情况(n=55)

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色 采用免疫组织化学染色检测组织芯片中FTO蛋白水平的表达。组织芯片经脱蜡、水化后，采用枸橼酸缓冲液高压修复抗原，冷却至常温。再用3% H2O2处理，避光封闭15 min；PBS洗涤3次，每次5 min；滴加山羊血清，37 ℃封闭30 min后；4 ℃过夜孵育兔抗人FTO单克隆抗体(编号27226-1-AP,稀释浓度为1∶100，武汉三鹰生物技术有限公司)；PBS洗涤3次，每次5 min，滴加兔通用IgG二抗(上海长岛生物科技有限公司)，37 ℃孵育30 min；PBS洗涤3次，每次5 min，滴加辣根过氧化酶标记的三抗，37 ℃ 孵育30 min；PBS洗涤3次，每次5 min后用DAB显色；流水冲洗15 min，苏木精复染1 min后，流水冲洗30 min，脱水封片，在光学显微镜下观察并采集图像。最后采用半定量方法评价FTO的表达情况，得分评价如下，FTO的染色强度评估：阴性(0分)、弱阳性(1分)、中阳性(2分)、强阳性(3分)；FTO的阳性染色的百分比：<5%(0分)、5%～<26%(1分)、26%～<51%(2分)、51%～75%(3分)、>75%(4分)。每个组织标本的FTO表达最终得分等于强度得分×百分比得分，总得分为0～12分，其中<9分为FTO低表达，≥9分为FTO高表达。

1.2.2qPCR检测 采用Triol法提取细胞总RNA，按照引物反转录试剂盒说明书进行操作，取200 ng总RNA经Bio-Rad反转录试剂反转录产生cDNA，产物在ABI 7500检测系统进行PCR反应，每个标本以GAPDH为内参。FTO基因引物序列如下，上游：5′-CCCTGTGAGCAGCAACATAAG-3′,下游：5′-CAACCCGACCCAGTCTAAATC-3′；GAPDH基因引物序列如下，上游：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′,下游：5′-GGGAAGGATCTGTCTCTGACC-3′；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。利用相应标本中GAPDH mRNA的比例计算组织中mRNA的表达水平，并将对照组中靶基因的表达水平设为1，对其他组中的靶基因的表达水平进行标准化计算。

1.2.3Western blot 采用细胞裂解法提取细胞总蛋白，即加入细胞RIPA裂解液，经匀浆、裂解、离心后，获得总蛋白，后通过Bradford方法检测总蛋白浓度，进行聚丙烯胺凝胶电泳，经恒流电转将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜上，后将聚偏二氟乙烯膜放入含5%脱脂奶粉的TBST封闭液中封闭，加入一抗加兔抗人FTO单克隆抗体(编号27226-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司，稀释浓度为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜，加入兔通用二抗(上海长岛生物科技有限公司)，37 ℃孵育1 h，洗膜后加入发光液显影。最后，采用分析系统软件测定蛋白条带的积分光密度值，以GAPDH蛋白条带作为内参对照。

1.2.4FTO干扰慢病毒载体感染 常规培养22RV1细胞，待细胞融合度达60%～80%。将其分为实验组、对照组和空白组3组，利用LipofectamineTM2000脂质体介导质粒转染FTO慢病毒干扰载体(pLVX-shRNA-FTO)至实验组细胞中，转染48 h后，使用2 μg嘌呤霉素稳定筛选FTO沉默细胞，提取细胞总蛋白，在蛋白水平上验证FTO干扰效果。

1.2.5侵袭实验 采用Transwell实验，按照细胞外基质胶∶无血清培养基为1∶7.5的配比在冰上稀释成使用液。把枪头剪去一小段(约3 μm)后在冰上吸取每孔40 μL细胞外基质胶使用液轻轻加入24孔板的8.0 μm的Transwell上室中，取实验组、对照组、空白组的细胞，分别接种8 000个细胞和200 μL DMEM培养基到Transwell上室中，并将500 μL DMEM培养基(含10%胎牛血清)置于下室中，每组设置3个复孔。在37 ℃和5% CO2条件下培养24 h，然后取出培养室，用PBS洗涤两次，用多聚甲醛固定10 min。将小室内未发生侵袭的细胞用棉签移除，将小室背面的细胞用0.1%的结晶紫染色并在显微镜下观察结果。

2 结 果

2.1FTO在前列腺癌组织中高表达 与癌旁组织比较，FTO在前列腺癌组织中表达水平更高，差异有统计意义(P<0.05)，见图1。

注：A为FTO在前列腺癌组织中的表达；B为FTO在前列腺癌旁组织中的表达;C为FTO在前列腺癌和癌旁组织的免疫组化评分图。图1 FTO在前列腺癌组织和癌旁组织中的表达比较

2.3高表达的FTO与前列腺癌的Grade分级的关系 据FTO组化评分，将FTO的表达分为高表达组30例和低表达组25例。结果表明，FTO的表达与前列腺癌的Grade分级有关，而与年龄、Gleason分级、淋巴结个数无关，见表2、3。

2.2FTO在前列腺癌细胞中高表达 Western blot结果表明，FTO在前列腺癌细胞PC3，Du145，22RV1，Lncap中的表达水平高于前列腺正常细胞RWPE，差异有统计学意义(P<0.05)；qPCR结果显示，FTO在前列腺癌细胞PC3，Du145，22RV1，Lncap中的mRNA表达水平高于前列腺正常细胞RWPE，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A为Western blot分析FTO在前列腺正常细胞和前列腺癌细胞中的蛋白表达图；B为FTO蛋白表达水平的定量柱状图，和RWPE细胞比较，aP<0.05；C为qPCR分析FTO在前列腺正常细胞和前列腺癌细胞中的mRNA定量表达图，和RWPE细胞比较，aP<0.05。图2 FTO在前列腺正常细胞和前列腺癌细胞中的表达

表2 FTO的表达与前列腺癌患者临床病理参数的关系

2.4FTO的下调抑制了22RV1细胞的侵袭能力 Western blot检测结果显示，与对照组和空载组比较，实验组细胞中FTO的蛋白表达水平降低；通过Transwell实验分析结果进一步表明，感染FTO慢病毒干扰载体(pLVX-shRNA-TFO)的前列腺癌细胞22RV1的侵袭能力降低。见图3、4。

表3 Spearman分析FTO的表达与前列腺癌患者临床病理参数的关系

注：A为Western blot分析FTO在对照组、空白组和实验组细胞中的蛋白表达图；B为FTO蛋白表达水平的定量柱状图，aP<0.05。图3 pLVX-shRNA-TFO感染22RV1细胞后的FTO蛋白表达图

注：A为Transwell分析对照组和实验组细胞侵袭能力；B为侵袭细胞数的定量柱状图。图4 Transwell实验分析pLVX-shRNA-TFO感染后对22RV1细胞侵袭能力的影响(×400)

3 讨 论

前列腺癌是威胁男性健康的常见恶性肿瘤，其全球发病率以每年5%的速度迅速增长[8]，据调查显示，我国前列腺癌发病率比30年前增加近3倍[9]。FTO是与肥胖关系密切的易感基因[10]，而肥胖是前列腺癌等癌症的危险因素，这提示FTO可能在介导肥胖和肿瘤发生之间发挥作用。现有研究数据表明，FTO与多种癌症的发生、发展和预后存在关联。例如，FTO在AML中高表达，促进人AML细胞的存活和增殖，并抑制人AML细胞的分化和凋亡，从而促进白血病的发生[11-12]。在雌激素受体表达阳性的子宫内膜癌中，FTO可以通过PI3K/Akt和MAPK信号通路诱导肿瘤细胞的生长和侵袭[13]。FTO在胃癌组织中高表达的同时能够促进胃癌细胞的增殖和迁移[14]。此外，在不同癌症中FTO表达的增加可能是由肥胖相关的FTO单核苷酸多态性引起的，从而促进肿瘤的发生和发展[15-17]，如，FTO rs9939609与前列腺癌相关。然而，关于FTO表达与前列腺癌发生发展的相关性，目前尚缺乏相关研究。

本研究通过免疫组织化学染色在55例前列腺癌组织与52例癌旁组织中检测了FTO的表达；且通过Western blot和qPCR实验在前列腺癌细胞PC3、22RV1、Du145、Lncap和前列腺正常细胞RWPE中检测了FTO的表达。FTO在前列腺癌细胞中的mRNA和蛋白表达水平均升高，与临床病理组织中表达升高的趋势一致，这些结果共同提示FTO的高表达可能与前列腺癌的发生密切相关，FTO高表达可能有助于前列腺癌的发生。通过结合临床病理资料分析发现FTO与前列腺癌的Grade分级具有相关性。在细胞水平干扰FTO的表达后，发现降低FTO的表达可抑制前列腺癌细胞的侵袭能力，提示FTO在前列腺癌中可能具有促进肿瘤细胞侵袭和转移的能力，其具体的分子机制还需在后续研究中进一步探索。

因此，本研究可为前列腺癌的治疗寻找合适的靶点提供实验依据，FTO可能成为前列腺癌的重要分子靶点。