老年性白内障患者晶状体上皮细胞CNN3、YAP表达与晶状体上皮细胞凋亡的相关性研究*

王 喆，王 敏，杨顺玲，梁 娜，黄 帅

河北省邯郸市眼科医院/河北省邯郸市第三医院眼科，河北邯郸 056001

白内障是由遗传、免疫等原因引起晶状体蛋白变性而发生浑浊的一种眼部疾病，其主要临床表现为单侧或双侧晶状体浑浊、视物不清晰等，中老年人为多发群体，发病率随年龄增大而升高。但白内障发病机制至今尚未完全明确，研究表明，晶状体的生长涉及上皮细胞的增殖及分化，而细胞生长分化受多种信号因子和机制的调节[1-2]。钙调节蛋白3(CNN3)是一种肌动蛋白结合蛋白，在神经系统发育、胚胎发育、肌细胞生成和细胞融合过程中发挥重要作用[3]。研究表明，CNN3是眼发育所需要的同源盒蛋白(OTX2)转录因子的下游靶基因[4]。Yes相关蛋白(YAP)是Hippo信号通路相关因子，在细胞生长发育凋亡过程中发挥作用，研究表明，Hippo/YAP通路在调控晶状体细胞生长中起重要作用[5-6]。何章彪等[7]研究表明，在大鼠晶状体上皮细胞中，成纤维细胞生长因子(FGF)诱导的核YAP表达在促进晶状体上皮细胞增殖中发挥重要作用，抑制YAP后，可显著抑制FGF诱导的晶状体细胞增殖。但是CNN3、YAP在白内障中的确切作用机制尚不明确。本研究检测老年性白内障晶状体上皮细胞中CNN3、YAP信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表达情况，分析CNN3 mRNA、YAP mRNA表达水平与晶状体上皮细胞凋亡的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2019年2月至2021年9月本院收治的老年性白内障患者67例作为老年性白内障组，所有患者均接受手术治疗，留取晶状体前囊膜标本，其中男37例，女30例；年龄58～76岁，平均(62.80±8.71)岁；病程2～5年，平均(3.50±1.20)年。纳入标准：(1)患者均符合老年性白内障诊断标准[8]；(2)最佳矫正视力≥0.5，角膜散光<1.00 D；(3)未患有青光眼、视神经炎、眼部发炎等其他眼部疾病。排除标准：(1)患其他类型白内障、外伤等眼部疾病者；(2)合并高血压、糖尿病及其他继发性视力减退疾病者；(3)合并认知障碍或精神疾病患者。另选取同期于本院进行角膜移植术并排除白内障的患者42例为对照组，其中男25例，女17例；年龄56～75岁，平均(61.90±8.63)岁。老年性白内障组和对照组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 Trizol试剂盒(批号BJK1596)、反转录试剂盒(批号BJK1813)、实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒(批号BJS8023)、兔抗人CNN3(批号ab204365)、YAP(批号ab52771)、β-肌动蛋白(β-actin，批号ab30157)单克隆抗体、鼠抗人二抗(批号ab90073)均购自美国Abcam公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(批号C1071S)购自南京立乔生物科技有限公司；qPCR仪(型号ProFlex)、蛋白免疫印迹成像系统(型号CL1500)、流式细胞仪(型号CJ1900)均购自深圳市德诚仪器科技有限公司。

1.3方法

1.3.1标本采集及保存 收集老年性白内障组与对照组患者的晶状体前囊膜(晶状体前囊膜主要由上皮细胞构成)，直径约6 mm，生理盐水冲洗后立即置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2qPCR法检测晶状体上皮细胞中CNN3 mRNA、YAP mRNA表达 应用Trizol试剂盒提取晶状体上皮细胞中的总RNA，反转录合成cDNA，采用qPCR试剂盒合成反应体系然后进行扩增，CNN3 mRNA、YAP mRNA和内参基因β-actin引物序列由北京奥科生物技术有限责任公司合成，引物序列见表1。反应条件：95 ℃ 90 s；94 ℃ 60 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，38个循环。反应结束后，CNN3 mRNA、YAP mRNA表达水平采用2-ΔΔCt法计算，每个标本重复3次，取平均值。

表1 引物序列

1.3.3蛋白免疫印迹法检测晶状体上皮细胞中CNN3、YAP蛋白表达 在晶状体上皮细胞中加入裂解液裂解30 min后，以12 000 r/ min离心30 min，取上清液，经电泳后转膜，10%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗CNN3、YAP和β-actin(稀释浓度1∶500)，4 ℃孵化过夜，TBST洗膜3次，再加入鼠抗人二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，使用ECL显色液显色，以β-actin为内参，对各条带进行灰度分析，以相对灰度值表示蛋白表达水平。

1.3.4流式细胞仪检测晶状体上皮细胞凋亡 晶状体上皮细胞经胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为每毫升1×105个，使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结 果

2.1对照组和老年性白内障组晶状体上皮细胞中CNN3 mRNA、YAP mRNA表达水平比较 与对照组比较，老年性白内障组晶状体上皮细胞中CNN3 mRNA表达水平升高，YAP mRNA表达水平降低(P<0.05)，见表2。

表2 对照组和老年性白内障组晶状体上皮细胞中CNN3mRNA、YAP mRNA表达水平比较

2.2对照组和老年性白内障组晶状体上皮细胞中CNN3、YAP蛋白表达水平比较 与对照组比较，老年性白内障组晶状体上皮细胞中CNN3蛋白表达水平升高，YAP蛋白表达水平降低(P<0.05)，见图1、表3。

表3 对照组和老年性白内障组晶状体上皮细胞中CNN3、YAP蛋白表达水平比较

图1 对照组和老年性白内障组晶状体上皮细胞中的CNN3、YAP蛋白印迹图

2.3老年性白内障患者晶状体上皮细胞中CNN3 mRNA与YAP mRNA表达水平相关性分析 老年性白内障患者晶状体上皮细胞中CNN3 mRNA与YAP mRNA表达水平呈负相关(r=-0.658，P<0.001)。

2.4对照组和老年性白内障组晶状体上皮细胞凋亡率比较 老年性白内障组晶状体上皮细胞凋亡率为(16.72±3.43)%，高于对照组的(2.98±0.45)%，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

注：A为对照组；B为老年性白内障组。图2 对照组和老年性白内障组晶状体上皮细胞凋亡流式图

2.5老年性白内障患者晶状体上皮细胞中CNN3 mRNA、YAP mRNA表达水平与晶状体上皮细胞凋亡率的相关性分析 老年性白内障患者晶状体上皮细胞中CNN3 mRNA表达水平与晶状体上皮细胞凋亡率呈正相关(r=0.414，P<0.001)，YAP mRNA表达水平与晶状体上皮细胞凋亡率呈负相关(r=-0.600，P<0.001)。

3 讨 论

白内障是由于晶状体调节功能失常而引起的晶状体混浊，由衰老、物理损伤、手术、炎症及药物等原因造成，可引起视物困难，给患者生活造成极大不便，白内障常发生于40岁以上人群，发病率与致盲率均居眼部疾病首位[9-10]。目前手术是治疗白内障的唯一有效手段，但术中及术后出现的各种并发症，给患者生活带来较大困难。因此，研究白内障发生机制，对白内障的诊断和治疗具有重要临床意义[11-12]。

CNN3是肌动蛋白结合分子CNN家族的成员，在平滑肌细胞及大脑神经细胞、星型胶质细胞中均有表达，缺乏CNN3的动物胚胎表现出发育中的大脑大量畸形，包括脑电图，延髓神经管的闭合缺陷及脑组织的强烈扩张[13-14]。还有研究表明，在细胞增殖过程中，敲除CNN3可导致细胞增殖和迁移减少，在分化过程中，CNN3可通过蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和腺苷酸活化蛋白激酶/mTOR通路抑制老鼠肌肉细胞的肌原性分化、融合和蛋白合成[15]。以上研究表明，CNN3在细胞增殖、发育与分化中起着重要调控作用，本研究结果显示，老年性白内障组晶状体上皮细胞中CNN3 mRNA和蛋白表达水平高于对照组，提示CNN3的异常表达可能与老年性白内障的发生相关。

YAP是Hippo信号通路的关键下游分子，在多种肿瘤组织中有表达，Hippo信号传导途径通过YAP来调节细胞生长、增殖与分化[16-17]。研究表明，YAP在晶状体上皮细胞增殖和晶状体纤维分化过程中起着重要作用[18]。另有研究表明，在FGF诱导的大鼠晶状体上皮外植体中，晶状体纤维分化与细胞质磷酸化YAP水平升高，抑制YAP可抑制FGF诱导的晶状体细胞增殖和晶状体纤维分化过程中的消融细胞伸长[19]。本研究结果显示，老年性白内障组晶状体上皮细胞YAP mRNA和蛋白表达水平低于对照组，表明YAP的低表达可能参与老年性白内障疾病的发生。然而CNN3、YAP在老年性白内障中的具体作用机制尚不清楚。

MADDALA等[4]研究表明，CNN3在调节晶状体上皮表型中发挥重要作用，并揭示了CNN3缺失可引起细胞形态、细胞黏附、极性的改变和收缩活性的增加，从而导致YAP/转录共激活因子PDZ结合基序激活和上皮间质转化。本研究结果显示，老年性白内障患者晶状体上皮细胞中CNN3 mRNA与YAP mRNA表达水平呈负相关(P<0.05)，提示CNN3、YAP可能共同参与调控老年性白内障的发生。由于外部损伤、年龄老化等因素会使晶状体上皮细胞活性降低，YANG等[20]研究显示，白内障的发生伴随晶状体上皮细胞的凋亡。本研究结果发现，老年性白内障组晶状体上皮细胞凋亡率高于对照组，提示晶状体上皮细胞凋亡可能与老年性白内障疾病的发生有关。相关性分析结果显示，老年性白内障患者晶状体上皮细胞中CNN3 mRNA表达水平与晶状体上皮细胞凋亡率呈正相关，YAP mRNA表达水平与晶状体上皮细胞凋亡率呈负相关(P<0.05)，提示YAP、CNN3可能通过某种作用机制调节晶状体上皮细胞凋亡，从而参与老年性白内障疾病的发生发展。

综上所述，老年性白内障患者晶状体上皮细胞中CNN3呈高表达、YAP呈低表达，与晶状体上皮细胞凋亡率有关，CNN3、YAP可能参与老年性白内障疾病的发生。二者在老年性白内障疾病中的具体作用机制尚不清楚，仍需做进一步研究。