脓毒症患儿外周血miR-146a、miR-223的表达及与预后的关系*

王 琳，高 洁△，耿 芳

河北省唐山市妇幼保健院：1.病案科；2.检验科，河北唐山 063000

脓毒症是一类常见的全身炎症反应综合征，其主要病理过程为在感染、创伤等因素作用下体内炎症因子及趋化因子水平升高，导致机体处于过度免疫反应状态，造成机体在清除病原体过程中对自身组织、器官也产生一定损伤[1-3]。流行病学资料显示，每年约有1 800万例新发脓毒症患者，部分患者甚至进展为脓毒症休克、多器官功能衰竭，严重威胁患者生命健康[4-6]。随着社会的发展，人们生活方式的改变，脓毒症发病率呈逐年上升趋势，给家庭乃至社会带来沉重负担[7]。目前，微生物培养为脓毒症诊断的金标准，但该方法存在耗时较长、准确率不高等缺点[8]，因此，探讨生物学指标用于脓毒症患儿病情严重程度判断及预后评估，有十分重要的临床意义。微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码小RNA分子，其可以通过调节机体基因表达抑制炎症反应等过程[9]。miRNA在细胞增殖、凋亡、分化等过程中发挥重要作用。有研究表明，miRNA可作为生物标志物用于疾病的诊断及预后评估[10]。miR-146a可影响机体炎症反应，已广泛运用于炎症反应疾病的诊断及评估中[11]。也有研究证实，miR-223在脓毒症患者炎症反应过程中发挥重要作用[12]。基于此，本研究通过探讨脓毒症患儿外周血miR-146a、miR-223的表达及与预后的关系，旨在为临床上诊治脓毒症患儿提供相关依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1月至2021年1月本院收治的93例脓毒症患儿为脓毒症组，其中男53例，女40例；平均年龄(1.93±0.34)岁。选取同期于本院进行体检的93例体检健康儿童为对照组，其中男57例，女36例；平均年龄(1.95±0.28)岁，两组性别、年龄比较，差异无统计学意义，具有可比性。脓毒症患儿纳入标准：(1)符合《脓毒症与感染性休克的国际共识》第三版相关诊断标准[13]；(2)重症监护室住院时间≥48 h；(3)入院时急性生理与慢性健康(APACHEⅡ)评分>12分；(3)临床资料完整；(4)年龄≤12周岁。排除标准：(1)入院时接受抗感染治疗者；(2)合并免疫缺陷疾病者；(3)合并其他感染性疾病者；(4)依从性差者。本研究经本院医学伦理委员会批准，患儿家属均签署知情同意书。

1.2方法 所有研究对象于入组时抽取静脉血7 mL，分成2管，1管2 mL，1管5 mL，2 mL那管以3 000 r/min离心5 min，分离血清，采用散射比浊法检测C-反应蛋白(CRP)水平(仪器购自深圳普门科技有限公司)，采用上转换发光技术(仪器购自北京热景生物)检测降钙素原(PCT)水平，试剂均购自唐山惠康生化免疫试剂有限公司；5 mL那管采用RNA提取试剂盒提取外周全血RNA，并根据反转录试剂盒进行反转录，根据SYBR实时荧光定量(qPCR)试剂盒(购自中国杭州博日科技有限公司)说明书进行qPCR。反应体系为95 ℃预变性30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，循环35次。采用2-ΔΔCt法计算各组miR-146a和miR-223相对表达水平，U6为内参，每个标本重复3次，取平均值。引物由中国北京鼎国生物科技有限公司合成，miR-146a上游引物序列为5′-CGGATCCTTGGTCTCCTCCAGATGTTTAT-3′，下游引物序列为5′-CCTCGAGTCATTAAAGTGATTTCTCCCAA G-3′；miR-223上游引物序列为5′-GCGCTGTCAGTTTGTCAAATACCC-3′，下游引物序列为5′-CGAATACCTCGGACC-3′；U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列为见5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

脓毒症组于入院时进行APACHEⅡ评分及序贯器官衰竭(SOFA)评分，并根据APACHEⅡ评分将脓毒症组患儿分为轻度组(42例)、中度组(29例)和重度组(22例)。APACHEⅡ评分包括急性生理评分、年龄评分及慢性健康评分3方面，分值越高代表患者预后越差[14]。SOFA评分主要内容为对患儿以连续的形式进行单个器官功能评价，分值越高代表患儿预后越差。随访28 d根据脓毒症患儿存活情况分为存活组(69例)和死亡组(24例)。

1.3观察指标 比较两组一般资料、CRP、PCT、miR-146a、miR-223水平；比较存活组和死亡组miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平，并采用受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平在评估患者预后中的临床价值。比较脓毒症患儿中轻、中、重度组上述指标水平，并采用Pearson相关分析脓毒症患儿miR-146a、miR-223水平与CRP、PCT水平及APACHEⅡ评分、SOFA评分的相关性。

2 结 果

2.1两组各指标水平比较 与对照组比较，脓毒症组外周血miR-146a、miR-223 mRNA水平及血清CRP、PCT水平升高(P<0.05)，见表1。

表1 两组各指标水平比较

2.2不同病情程度脓毒症患儿各指标水平比较 与轻度组比较，中度组和重度组脓毒症患儿外周血miR-146a、miR-223 mRNA水平及血清CRP、PCT水平升高(P<0.05)；与中度组比较，重度组脓毒症患儿外周血miR-146a、miR-223 mRNA水平及血清CRP、PCT水平升高(P<0.05)，见表2。

表2 不同病情程度脓毒症患儿各指标水平比较

2.3脓毒症患儿的miR-146a、miR-223水平与CRP、PCT水平及APACHE Ⅱ评分、SOFA评分的相关性分析 脓毒症患儿的miR-146a、miR-223水平与CRP、PCT水平及APACHE Ⅱ评分、SOFA评分均呈正相关(P<0.05)，见表3。

表3 脓毒症患儿的miR-146a、miR-223水平与CRP、PCT水平及APACHE Ⅱ评分、SOFA评分的相关性分析

2.4存活组和死亡组miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平比较 与存活组比较，死亡组miR-146a、miR-2233、CRP及PCT水平升高(P<0.05)，见表4。

表4 存活组和死亡组miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平比较

2.5miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平在评估脓毒症患儿预后中的临床价值 miR-146a最佳临界值为4.837，其在评估患儿预后的AUC为0.898；miR-223最佳临界值为12.362，其在评估患儿预后的AUC为0.875；CRP最佳临界值为39.391 mg/L，其评估患儿预后的AUC为0.654；PCT最佳临界值为3.197 ng/mL，其评估患儿预后的AUC为0.714，见表5、图1。

表5 miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平在评估患儿预后中的临床价值

图1 ROC曲线结果

3 讨 论

脓毒症的本质为机体对病原体的免疫反应引起过度炎症反应，进而导致自身组织器官的损伤。研究表明，临床对脓毒症的诊断延迟、病情及预后评估不准确将导致脓毒症患者病死率升高，因此早期治疗及对病情进行有效评估具有十分重要的临床意义[8]。

脓毒症患者体内会释放大量炎症因子，而这一类炎症因子可促进机体抵御病原体的侵袭，但当炎症因子水平过度表达时又会引起免疫反应的失衡，导致免疫功能紊乱。目前，临床上采用部分炎症因子作为评估病情的辅助指标之一。PCT主要由甲状腺C细胞分泌，正常生理条件下，PCT水平极低，而一旦患者发生感染时，肝脏巨噬细胞及单核细胞在内毒素等因素的刺激下，机体大量分泌PCT，导致血清PCT水平升高，并在感染12～24 h时达到峰值[15-16]。CRP是一类急性时相反应蛋白，具有出现时间早，水平升高迅速等特点。当机体发生感染性疾病时，CRP水平将会出现不同程度的升高。研究表明，CRP作为检测机体炎症反应的敏感性指标，当机体发生感染时，其水平将升高，且水平变化往往不受放化疗药物及激素类药物的影响[17-18]。本研究结果显示，相较于健康儿童，脓毒症患儿CRP、PCT水平均有所升高。但研究表明，PCT水平升高主要由细菌性感染或细菌释放的内毒素和炎症因子所致，而机体发生病毒性感染或在其他因素刺激下往往并不会引起PCT水平升高，而脓毒症往往也受病毒感染影响[15]。此外CRP在自身免疫性疾病、烧伤等情况下水平也有所升高，具有特异性较差的缺点[17-18]。因此将PCT或CRP作为脓毒症的生物标志物往往存在各自的缺点，难以获得较好的效果。笔者进一步发现，相较于存活组，死亡组PCT及CRP水平均有所升高，但CRP及PCT水平在评估患者预后中的AUC<0.8，且灵敏度及特异度不高。这也进一步说明CRP及PCT作为脓毒症的生物标志物中存在一定不足。

miRNA是一类内源性非编码小RNA分子，可调控细胞分化、增殖、凋亡、代谢等生物学过程，且其水平异常往往与炎症反应及免疫调节等过程密切相关[9]。miR-146a为miRNA家族成员之一，既往研究发现，在miR-146a与巨噬细胞极化存在密切联系，在巨噬细胞抵抗病原菌入侵的炎症反应过程中，miR-146a呈过表达[19]。已有研究证实，miR-146a可能参与脓毒症的发生发展[20]。侯果等[21]的研究发现，相较于健康人群，脓毒症患者外周血miR-146a水平升高，本研究也得到较为一致的结论。此外，本研究还发现，随着患者病情严重程度的增加，其外周血miR-146a水平也有所升高，且miR-146a水平与CRP、PCT水平及APACHEⅡ评分、SOFA评分均呈正相关，这也提示脓毒症患者miR-146a水平升高，并与患者病情程度及炎症反应程度密切相关。miR-223为近年来发现的一类位于X染色体上的miRNA，其在骨髓谱系中呈特异性表达，既往已有研究报道了miR-223可作为生物标志物用于疾病的诊断及病情评估[22]。还有研究证实，miR-223与机体造血功能、免疫反应等过程密切相关，并可调节机体炎症反应，并提示miR-223可能参与脓毒症的发生发展[23]。本研究结果显示，相较于健康儿童，脓毒症患儿miR-223水平升高，并与患者病情程度及炎症反应程度密切相关，这也进一步证实miR-223参与脓毒症的发生发展。本研究也通过ROC曲线分析了miR-146a和miR-223在评估脓毒症患儿预后中的临床价值，结果显示，miR-146a最佳临界值为4.837，其在评估患儿预后中的AUC为0.898；miR-223最佳临界值为12.362，其在评估患儿预后中的AUC为0.875，提示miR-146a和miR-223在评估脓毒症患儿预后中均具有一定的临床价值。

综上所述，脓毒症患儿miR-146a、miR-223、PCT、CRP水平升高，并与患儿病情严重程度及炎症反应密切相关，miR-146a、miR-223水平在评估脓毒症患儿预后中均具有一定临床价值，但PCT及CRP水平在评估患儿预后中的临床价值并不显著。但本研究也存在以下不足：(1)未动态观察各指标变化情况，难以获得连续性资料；(2)研究所纳入样本量较少，且样本来源为单中心。因此，后续仍需多中心、大样本的研究进一步加以证实。