慢性脑缺血及急性缺血性脑卒中患者循环内皮祖细胞及其诱导因子的表达变化

李盈洁，王 卢，杨 旭，杨 波，章 鑫，张 静，张 琦，成旭东，余能伟，

(1.西南医科大学临床医学院，四川 泸州 646000；2.电子科技大学医学院，四川 成都610054；3. 四川省乐山市中医院，四川 乐山 614099；4.四川省医学科学院·四川省人民医院神经内科，四川 成都 610072)

慢性脑缺血(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)是脑整体水平血液供应减少状态，但无局灶性神经功能缺损[1]。根据CCH按缺血程度分型[2]可知，随缺血程度分级的升高，发生急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS)风险越大，由此可见CCH是卒中前状态，若为脑血管狭窄所致的CCH可导致卒中发生。CCH发生后，缺血脑组织会有代偿毛细血管新生[3]，此机制尚不明确。目前认为内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在缺血性脑血管病组织修复和再生中起关键作用[4]。EPCs的表达与其诱导因子：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[5]、低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)[6]、基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)[7]的表达具有密切关系。本研究探讨CCH及AIS患者EPCs及其诱导因子的表达情况，探索EPCs及其诱导因子在CCH中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料2021年2月至2021年7月四川省人民医院门诊就诊的CCH患者34例(CCH组)，纳入标准：年龄45～80岁[2，8]；符合《慢性脑缺血中西医结合诊疗专家共识》中提出的诊断标准[2]。排除标准：近期大面积脑梗(超过大脑中动脉供应区 1/3)；结缔组织病、血管炎；急性心肌梗死；近期房颤或心瓣膜疾病；严重肝肾功损伤；严重感染；女性患者怀孕或备孕；幽闭恐惧症；近三月内有服用他汀、阿司匹林、泰嘉药物史；其他严重合并症；不愿意入组者。同期于四川省人民医院神经内科绿色通道收治、影像学提示为急性脑梗死、发病在24小时内的住院AIS患者31例(AIS组)，纳入标准：符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》提出的AIS诊断标准；发病24小时内。排除标准：结缔组织病、血管炎；急性心肌梗死；近期房颤或心瓣膜疾病；严重肝肾功损伤；严重感染；女性患者怀孕或备孕；幽闭恐惧症；近三月内有服用他汀、阿司匹林、泰嘉药物史；其他严重合并症；不愿意入组者。对照组为同期四川省人民医院健康体检人群25例。本研究经四川省医学科学院·四川省人民医院伦理委员会审核通过，所有患者或家属签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1临床资料收集 收集所有研究对象的年龄、性别、吸烟、饮酒、既往史(高血压、糖尿病、高血脂)等临床资料。

1.2.2采用动脉自旋标记(ASL)检查证实CCH患者具有脑血流低灌注区 使用美国3.0T GE Discovery MR750W磁共振扫描仪对CCH患者进行核磁共振成像检查。扫描时取仰卧位，嘱患者尽可能减少头部运动。常规行颅脑磁共振扫描：T1W图像的采集参数为：TR 250.00 ms，TE 2.50 ms；T2W图像的采集参数为：TR 5744.40 ms，TE 95.00 ms；T2W FLAIR图像的采集参数：TR 10500.00 ms，TE 94.00 ms；3D-ASL的采集参数：TR 2824.5 ms，TE 11 ms，FOV 192mm×192 mm，矩阵64×64，层厚5.0 mm，激励次数1次，扫描层数25层，标记时间为 700 ms、1600 ms、1800 ms，扫描时间4 min 29 s 。ASL图像分析：采用ASL专用的分析软件产生灌注彩图，灌注彩图中红色代表高灌注，蓝色代表低灌注。2名影像科副主任医师及1名神经内科副主任医师采用盲法观察ASL图像，确定有无脑血流低灌注区。

1.2.3流式细胞仪技术检测EPCs的表达量 采用EDTA管抽取纳入患者外周血1 ml。CCH组及对照组采血时间为早上6～8时，抽取空腹血；AIS患者采血时间为入院后半小时内。取外周血50 μl，加入PE标记的CD309单克隆抗体20 μl、APC标记的CD133单克隆抗体5 μl和BV421标记的CD34单克隆抗体5 μl，20 ℃避光孵育15 min；加入红细胞裂解液900 μl，避光孵育10 min；加入磷酸盐缓冲液 3000 μl混匀，2469rpm离心5 min，去上清；加入 400 μl PBS 缓冲液重新悬浮；采用流式细胞仪，收集细胞进行分析。以CD34+细胞表示为干细胞，以CD34+/CD309+/CD133+三阳性细胞表示EPCs，统计CD34+/CD309+/CD133+三阳性细胞占CD34+细胞的百分比，即为 EPCs水平。

1.2.4酶联免疫吸附法检测VEGF、HIF-1、SDF-1表达情况 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测外周血VEGF、HIF-1、SDF-1含量。采用美谷分子仪器有限公司生产的酶标仪(型号SpectraMAX Plus384)在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。实验过程严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学方法采用SPSS 25.0统计学软件分析数据。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD法。非正态分布或方差不齐的计量资料以M(P25，P75)表示，组间比较采用Kruskal-WallisH检验法。计数资料以n(%)表示，组间比较采用卡方检验。采用Spearman相关性分析比较变量之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组临床资料比较对照组、CCH组、AIS组年龄、性别、饮酒率、糖尿病患病率、高血脂患病率比较差异无统计学意义(P>0.05)。AIS组吸烟率高于CCH组(P<0.05)；CCH组、AIS组高血压患病率高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 三组临床资料比较

2.2 CCH组及AIS组主要临床表现CCH组21例(61.76%)主要临床表现为头晕，8例(23.53%)存在头晕、头痛、耳鸣、睡眠障碍中的2种或2种以上症状， 2例(5.88%)表现为头痛，1例(2.94%)表现为耳鸣，1例(2.94%)表现为颅鸣，1例(2.94%)表现为记忆力下降。AIS组14例(45.16%)存在肢体麻木、肢体无力、言语不清、头晕、口角歪斜中的2种及以上症状，12例(38.71%)表现为肢体无力，3例(9.68%)表现为言语不清，1例(3.23%)表现为意识障碍，1例(3.23%)表现为视物模糊。AIS组美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分为3(2，6)分。

2.3 CCH组与AIS组影像学表现

2.3.1CCH组影像学表现 CCH患者头颅核磁未见明显梗塞灶、颅内占位性病变、脑出血及颅内血管狭窄改变。CCH患者中，多发脑血流低灌注病灶27例(79.41%)，颅内单发脑血流低灌注7例(20.59%)。脑血流低灌注部位有额叶者21例(61.76%)，有半卵圆中心者13例(38.24%)，有顶叶者8例(23.53%)，有基底节区者6例(17.65%)，有侧脑室旁者5例(14.71%)，有颞叶者2例(5.88%)，有枕叶者1例(2.94%)，其中脑血流低灌注部位多见于额叶及半卵圆中心。见图1。

图1 CCH患者影像学图像 a：T1W；b：T2W；c：Flair；d：头颅MRA未见血管狭窄；e：ASL未见脑组织低灌注区；f、g：ASL可见脑组织低灌注区(红色箭头处，蓝色)

2.3.2AIS组影像学表现 患者头颅CT可见低密度影；头颅核磁可见长T1及长T2信号，FLAIR像可见高信号影，DWI像可见病变部位弥散受限，行头颈MRA/CTA/DSA 可见动脉狭窄或闭塞改变。患者均行头颈动脉血管检查，其中26例(83.87%)患者头颈部动脉存在不同程度狭窄和(或)闭塞改变。见图2。

图2 AIS组影像学图像 a：CT ；b：T2W；c：Flair；d：DWI；a～d：右侧枕叶、海马区急性脑梗死病灶；e：CTA示右侧大脑中动脉M1中远份显示欠佳，远段分支稀疏、变少(白色箭头处)；f：CTA示右侧大脑后动脉远段分支较左侧纤细、变少，为此次AIS发生的责任血管(红色箭头处)

2.4 三组EPCs水平、VEGF、HIF-1、SDF-1表达量比较三组EPCs、VEGF、HIF-1、SDF-1表达水平组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。CCH组EPCs、VEGF、HIF-1表达均高于对照组(P<0.05)，SDF-1表达量较对照组差异无统计学意义(P>0.05)。AIS组EPCs、VEGF、HIF-1表达均高于对照组，SDF-1表达低于对照组(P<0.05)。AIS组与CCH组比较，VEGF表达升高(P<0.05)，EPCs、HIF-1、SDF-1差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图3。

表2 三组EPCs水平、VEGF、HIF-1、SDF-1表达量比较

图3 三组EPCs流式细胞检测图 a：对照组；b：CCH组；c：AIS组

2.5 AIS组VEGF与HIF-1的相关性分析AIS组VEGF的变化与HIF-1的变化呈正相关(r=0.513，P=0.004)。

3 讨论

缺血性脑血管病按照起病形式主要分为急性起病和慢性起病，急性起病主要包括AIS和短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack，TIA)，慢性起病主要为CCH，由于AIS和TIA可导致严重后果，故目前的研究热点主要集中于急性缺血性脑血管病，但是二者之间是可以相互转化的。本研究发现，CCH患者脑缺血部位多为额叶及半卵圆中心，且多为颅内多发脑组织缺血。杨旭等[9]也发现CCH患者行影像学检查可查出多部位缺血灶，多位于半卵圆中心、基底节区、额叶等部位，本研究结果与其基本一致。CCH可出现头晕、头痛、记忆力下降、认知功能障碍等表现[2，8]，作为一种可逆性疾病，其可干预的时间窗较长。调查显示，65岁以上人群中66.7%存在CCH[2，8]，在这种高发病率的背景下，研究CCH的发病机制对减轻我国脑血管疾病负担非常重要。

CCH发病机制复杂[2,8]，目前认为的机制主要包括胶质细胞增殖活化、氧化应激反应、细胞凋亡、神经递质紊乱等[8，17]。慢性脑缺血发生后，脑血流灌注降低，缺血脑组织会有代偿毛细血管新生[3]，但这样的新生血管仅能部分代偿血流灌注，如果能促进这种代偿机制，则可促进慢性脑缺血的防治。本研究提示CCH发生后EPCs的表达水平升高，提示EPCs可能参与CCH后脑组织血管的新生，改善脑血流；且我们发现CCH组VEGF、HIF-1的表达量升高，提示CCH发生后EPCs表达变化的升高可能与VEGF、HIF-1有关。研究显示慢性脑灌注不足可诱导大鼠脑中VEGF表达的持续上调[18]，通过刺激HIF-1α / VEGF信号通路，可促进血管生成，改善慢性脑缺血患者的认知功能障碍[19]。

CCH按缺血程度主要分为3型[2]，其中Ⅰ型主要是临床症状+脑血管病危险因素，Ⅱ型在I型的基础上合并脱髓鞘病变等影像学改变，Ⅲ型在Ⅱ型基础上合并血管结构性改变(如血管狭窄或闭塞)，随分级程度升高，发生脑卒中的危险性越大。我们发现，AIS组患者头颈部动脉存在不同程度狭窄和(或)闭塞改变，认为AIS患者卒中发生的主要原因为在CCH血管病变的基础上，突发血管狭窄和(或)闭塞加重，进而从CCH转化为AIS。与CCH组比较，EPCs的表达无明显差异，VEGF的表达升高，提示CCH向AIS早期转化过程中，虽然EPCs的表达变化不明显，但其诱导因子VEGF已经在发生变化。但CCH向AIS转化后，中晚期EPCs及诱导因子如何变化，还需进一步探索。

综上所述，本研究发现CCH患者脑缺血部位多见于额叶及半卵圆中心，多为颅内多发脑组织缺血；CCH患者与早期AIS患者EPCs升高，可能与VEGF及HIF-1升高有关，且CCH向AIS早期转化过程中，虽然EPCs的表达变化不明显，但其诱导因子VEGF已经在发生变化，提示EPCs及其诱导因子可能在CCH的病理生理学过程中发挥重要作用，本研究为今后EPCs在CCH中的研究奠定基础。