烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型在产后抑郁中的作用机制研究

冀 荔，李月琴，王烈宏

(青海红十字医院妇产科，青海 西宁 810000)

产后抑郁(postpartum depression，PPD)是一种以产褥期持续抑郁为特征的精神障碍，主要表现为抑郁、失眠、焦虑、悲伤、内疚、易怒甚至有自杀倾向[1]。PPD不仅影响产妇的身心健康，而且剥夺了母亲对婴儿的有效照顾，影响婚姻关系[2]。然而PPD的病理机制尚不清楚。因此探索PPD的病理机制并寻找其发展的关键靶点具有紧迫性。烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(α7 subtype of nicotinic acetylcholine receptors，α7nAChR)通过调节免疫系统的迷走神经上调抗炎通路[3]。激活α7nAChR可能是炎症相关精神和神经疾病的潜在治疗方法[4]。先前研究发现，α7nAChR的药理学激活在暴露于慢性应激的小鼠中产生抗抑郁作用[5]。因此有理由推测α7nAChR在PPD中起着关键作用。本研究建立了激素模拟妊娠(hormone-simulated pregnancy，HSP)诱导的PPD小鼠模型，以确定α7nAChR在PPD中的作用，旨在提供一些新的治疗PPD的思路。

1 材料与方法

1.1 材料实验时间2021年1～6月。C57BL/6J小鼠50只(雌性，3个月大)购自上海sipprbk实验动物有限公司。小鼠饲养在环境温度为(22±2)℃和12∶12小时光/暗循环的房间内自由获取食物和水。动物实验经青海红十字医院伦理委员会审核批准(QHLY-2019-011)，并严格遵循实验动物使用的3R原则。

1.2 PPD小鼠模型建立参照文献方法[6]将雌性C57BL/6J小鼠制成HSP诱导的PPD模型。在1%戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉下使用无菌技术对它们进行双侧卵巢切除术，并恢复7天。将去卵巢的小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(20 μg/kg，溶于芝麻油)和黄体酮(32 mg/kg，溶于芝麻油)，每天1次，连续16天。然后停用黄体酮并继续服用高剂量苯甲酸雌二醇 (400 μg/kg) 7天。对照小鼠进行假手术并仅接受芝麻油。最后一次注射后进行为期10天的PNU282987治疗，然后进行行为评估。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(60 mg/kg)，然后快速颈椎脱位处死。

1.3 分组处理将50只小鼠分为2个独立的实验组。

1.3.1实验组1 考察PNU282987(α7nAChR激动剂)对HSP诱导的PPD模型小鼠抑郁样行为以及α7nAChR表达、NLRP3炎症小体激活影响。将C57BL/6J小鼠随机分为3组各10只，对照组：假手术加腹腔注射生理盐水治疗； PPD组：PPD加生理盐水腹腔注射； PNU282987组：PPD加腹腔注射PNU282987，1 mg/(kg·d)，持续10 d，购自英国Abcam公司。

1.3.2实验组2 为确认α7nAChR在PPD小鼠中的神经保护作用，研究采用α7nAChR inhibitor抑制小鼠海马组织中α7nAChR表达。将C57BL/6J小鼠随机分为2组各10只，①PNU282987组：PPD加腹腔注射PNU282987，1 mg/(kg·d)；②PNU282987+α7nAChR inhibitor组：PPD加腹腔注射PNU282987 1 mg/(kg·d)，α7nAChR inhibitor 5 mg/(kg·d)，持续10 d，购自广州锐博生物科技有限公司。

1.4 行为评估

1.4.1尾悬试验(TST)[7]小鼠的尾巴用胶带缠住，倒扣在钩子上。记录每只小鼠的不动时间6分钟。只有当小鼠被动地悬挂并且完全静止时，它们才被认为是不动的。最后4分钟的不动时间用TailSuspScan(美国Clever Sys公司)测量。

1.4.2强制游泳测试(FST)[7]迫使小鼠在室温下[约(22±1)℃]充满水的开口圆柱形容器(高25 cm，直径10 cm)中游泳6 分钟，深度为14 cm。当小鼠以直立姿势漂浮时，不动被定义为仅进行很小的运动以将其头部保持在水面之上以满足呼吸的需要。在最后4分钟内采用TailSuspScan(Clever Sys)记录了不动的持续时间。

1.5 Nissl染色实验结束时用戊巴比妥钠麻醉。将生理盐水注入左心室，然后灌入PBS和4%多聚甲醛。收集脑组织固定在OCT包埋剂(德国Leica公司)并冷冻。每个大鼠脑切片的厚度为30 μm，并用Nissl染色液染色。在400倍BX 41型号光学显微镜(日本Olympus公司)下观察海马CA1区Nissl染色切片。

1.6 免疫荧光嵌入的脑组织通过冷冻切片机切片。脑切片的厚度为10 μm。根据实验程序，首先使用山羊血清进行阻断。然后将抗体α7nAChR(1∶200，美国Cell Signaling公司)在4 ℃下孵育过夜。次日，将切片与荧光抗体在室温下孵育1 h，并在荧光显微镜(日本Nikon公司)下拍照，观察海马CA1区免疫荧光染色。

1.7 蛋白质印迹分析使用含有1%蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液(美国Thermo Scientific公司)从海马组织中提取蛋白质。在4 ℃下以12000 × g离心20分钟后收集上清液。将提取的蛋白质加入5 ×体积的上样缓冲液中，95 ℃变性5分钟。在SDS-PAGE凝胶上分离等量的每种蛋白质样品，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用含0.1% Tween-20/Tris缓冲盐水(TBS-T)的5%脱脂牛奶封闭1 h。然后，将膜与α7nAChR (1∶1000)、NLRP3 (1∶500)、NF-κB p65 (1∶500)、NF-κB p-p65 (1∶500)、pro-IL-1β (1∶1000)、IL-1β (1∶1000)、pro-cleaved-caspase 1 (1∶500)、cleaved-caspase 1(1∶500)、或甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH，1∶1000)抗体(均购自美国Cell Signaling公司)在4 ℃下孵育过夜。在室温下将辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗孵育1小时后，使用增强型化学发光试剂(美国Millipore公司)通过化学发光检测观察蛋白质条带。

1.8 统计学方法应用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。计量数据使用t检验或单向方差分析，然后通过Tukey进行多重比较检验。数据表示为至少3个独立实验的均数±标准差。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSP诱导的PPD模型小鼠抑郁样行为评估与对照组及PNU282987组相比，PPD组小鼠在尾悬测试和强迫游泳测试中的不动时间显著增加(P<0.001)。Nissl染色结果显示，PPD组海马CA1区Nissl染色的神经细胞数量较对照组及PNU282987组显著减少(P<0.001)。见表1。

表1 PPD模型小鼠的行为评估

2.2 PPD小鼠海马组织中α7nAChR表达情况比较与对照小鼠相比，PPD组小鼠海马组织α7nAChR的蛋白质表达显著降低(1.00±0.04 vs 0.32±0.04，P<0.001)(图1)。双重免疫荧光结果显示，PPD组小鼠海马CA1区神经元中α7nAChR染色显著降低(25.16±3.03 vs 8.21±1.65，P<0.001)。PNU282987治疗显著增加了PPD小鼠海马组织中α7nAChR表达(蛋白质水平：0.73±0.08 vs 0.32±0.04；α7nAChR阳性表达面积：16.35±2.01 vs 8.21±1.65，P<0.01)。

图1 PPD小鼠海马组织中α7nAChR的表达情况

2.3 PNU282987在体内抑制NLRP3炎症小体激活情况比较与对照组及PNV282987组相比，PPD小鼠海马组织中NLRP3、NLRP3炎症小体相关启动效应子NF-κB、激活效应子pro-IL-1β、cleaved-caspase 1和IL-1β的表达显著增加(P<0.05)。PNU282987治疗显著降低了PPD小鼠海马组织中NLRP3、NF-κB、pro-IL-1β、cleaved-caspase 1和IL-1β表达(P<0.05)。见图2、表2。

图2 小鼠海马组织中NLRP3炎性体信号的免疫印迹分析 (n=4)。

表2 光密度分析定量NLRP3、NF-κB p65、磷酸化-NF-κB、cleaved-caspase 1、IL-1β的相对表达

2.4 抑制α7nAChR表达对PNU282987的神经保护作用影响为了进一步确认α7nAChR在PPD小鼠中的神经保护作用，采用α7nAChR inhibitor抑制小鼠海马组织中α7nAChR表达，并通过免疫印迹证实小鼠海马组织中α7nAChR表达显著降低(1.00±0.04 vs 0.22±0.03，P<0.001)(图3a)。与PNU282987组小鼠相比，PNU282987+α7nAChR inhibitor组小鼠在尾悬测试(86.07±2.64 vs 148.92±3.73，P<0.01)和强迫游泳测试(65.37±2.33 vs 127.53±4.45，P<0.001)中的不动时间显著增加，且海马CA1区Nissl染色的神经细胞数量显著降低(303.42±6.53 vs 247.82±5.19，P<0.05)。此外，α7nAChR inhibitor逆转了PNU282987对PPD小鼠海马组织中NLRP3、NF-κB、pro-IL-1β、cleaved-caspase 1和IL-1β表达的抑制作用(P<0.05)。见表3、图3b。

表3 光密度分析定量NLRP3、NF-κB p65、磷酸化-NF-κB、cleaved-caspase 1、IL-1β的相对表达

图3 抑制α7nAChR表达对PNU282987的神经保护作用 a：PNU282987组和PNU282987+α7nAChR inhibitor组小鼠海马组织中α7nAChR蛋白表达；b：小鼠海马组织中NLRP3炎性体信号的免疫印迹分析

3 讨论

现代女性工作和生活压力很大，PPD的发病率也呈上升趋势[8]。PPD不仅严重损害女性的身心健康，而且对婴儿的健康成长、家庭和睦、社会稳定也带来有害影响[9]。PPD的病理机制尚未完全阐明，研究报道通常涉及单胺递质缺乏、神经内分泌紊乱、神经营养因子内分泌减少、氧化应激、神经炎症假说等[10]。在本研究中，PPD诱导α7nAChR表达降低，进而激活NLRP3炎性体，导致海马区Nissl染色的神经细胞数量显著减少，出现抑郁样行为。

α7nAChR是大脑中的主要nAChR亚型，对钙具有较高的相对渗透性。α7nAChR的位置及其钙渗透性使受体能够调节递质释放和突触可塑性[11]。α7nAChR激动剂DMXBA显著改善了慢性束缚应激诱导的抑郁样行为[5]，表明α7nAChR可能是治疗抑郁样症状的靶点。在戒断尼古丁的小鼠中，PNU282987可以以剂量相关的方式减少焦虑样行为[12]。α7nAChR在与抑郁症有关的炎症中起着重要的抗炎作用[13]。研究发现，Chrna7 KO小鼠通过全身炎症表现出抑郁样表型[14]。α7nAChR的药理学激活在炎症呈递小鼠中产生了类似抗抑郁药的作用[15，16]。本研究发现，通过向PPD小鼠注射选择性α7nAChR激动剂PNU282987能够减轻小鼠抑郁样行为，增加了海马CA1区神经细胞数量。进一步研究显示，α7nAChR上调抑制了PPD诱导的NLRP3炎性体激活，表明α7nAChR可能通过减少NLRP3炎性体激活对PPD神经炎症中发挥抗炎作用。

越来越多的证据表明炎症小体诱导的神经炎症是PPD发病机制的重要组成部分[7]。NLRP3炎症小体是研究最多的炎症小体。为了成功激活NLRP3炎症小体，提出了两个信号：①信号1(启动)。NLRP3和pro-IL-1β的转录需要启动信号。②信号2(激活)。激活信号负责NLRP3炎症小体的组装和激活[17]。最近的一项研究报告，在HSP诱导的小鼠PPD模型中发现海马组织中NLRP3炎症小体激活[18]。与该结果类似，我们的研究表明，PPD小鼠海马组织中NLRP3炎性体激活和IL-1β的水平显著增加。为了进一步确认α7nAChR对PPD小鼠中的神经保护作用是否与减少NLRP3炎性体激活有关，研究采用α7nAChR inhibitor抑制小鼠海马组织中α7nAChR表达，并发现PNU282987对PPD小鼠抑郁样行为的改善作用被显著逆转，并且NLRP3炎性体激活。这些发现证明了α7nAChR抑制NLRP3炎症小体诱导的PPD神经炎症。