白藜芦醇调控hsa-miR-4689-3p、hsa-miR-4741-3p保护肾小球系膜细胞

张 铭，于昕新，浦荭秋，田 阳，韩铠禧，赵天月，梁竞天，杨 果，闵钰淇，石 艳

(吉林大学药学院，吉林 长春130021)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见并发症，肾小球系膜细胞(mesangial cells，MCs)是DN极其重要的靶细胞。MicroRNA(miRNA)是人体中普遍存在的重要调节因子。研究表明，miRNA对肾小球系膜细胞的肥大具有调节作用[1-3]，miRNA可以作为DN早期检测和进展的生物标志物[4]。miRNA通过靶向其各自的靶标来调节与纤维化相关的基因的表达，从而影响了DN中肾纤维化的进程[5]。白藜芦醇是天然具有抗氧化作用的多酚类物质，可抑制肾小球系膜细胞增殖[6]，改善肾脏组织当中的脂毒性、内皮功能障碍、细胞凋亡以及氧化应激等[7]，具有降血糖作用[8]，但其对高糖下的MCs中miRNA的影响目前尚不明确。我们前期研究采用miRNA芯片技术筛选出肾小球系膜细胞正常组，高糖组和白藜芦醇药物干预组这三组特异性差异表达的MicroRNA。本研究拟结合文献和前期结果，选择hsa-miR-4689-3p、hsa-miR-4741-3p作为研究对象，采用real-time PCR技术检测其在各组肾小球系膜细胞中的相对表达量，通过生物信息学软件预测靶基因，探讨白藜芦醇对高糖下肾小球系膜细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器DMEM高糖培养基(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，胎牛血清(天津灏洋生物制品有限公司，中国)，白藜芦醇(南京景竹生物科技有限公司，中国)，TransScript 反转录反应体系One-Step gDNA Removal (北京全式金生物技术有限公司，中国)，通用RNA提取试剂盒(离心柱型)(广州东盛生物科技有限公司，中国)，hsa-miR-4689(广州易锦生物技术有限公司，中国)，hsa-miR-4741(广州易锦生物技术有限公司，中国)。Stratagene实时荧光定量PCR仪(美国安捷伦公司，美国)。

1.2 MCs的复苏，培养、传代及分组水浴融化HMCs细胞并滴加10 ml的DMEM低糖培养液(10%胎牛血清)。离心，弃上清，10 ml完整营养物质的培养液吹散细胞，计数、调整密度后接种于培养瓶中。置于培养箱(37°C，5%CO2)中培养，隔天更换培养基，PBS洗两次，每个培养基补充至8 ml，置于培养箱中继续培养。将肾小球系膜细胞分为空白对照组(Con)，高糖组(HG)和白藜芦醇组(Res)。

1.3 real-time PCR检测差异表达的microRNATrizol提取MCs的total RNA。MicroRNA以加尾法进行逆转录得到有更高长度的逆转录产物cDNA来进行下一步中PCR扩增。按照TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书操作，用2-△△CT法测定相对表达量。

1.4 靶基因预测采用MiRanda与TargetScan两个数据库对差异microRNA进行靶基因预测。

1.5 统计学处理SPSS19.0 软件分析统计数据，所有数据用平均数±标准差表示，组间差异用方差分析进行统计学检验，组间两两比较采用最小显著差法。P<0.05 为差异具有统计学意义，P<0.01 为差异具有显著性统计学意义。

2 结果

2.1 real-time PCR检测差异表达microRNA与Con组相比，HG组中的hsa-miR-4689-3p与hsa-miR-4741-3p的相对表达量明显降低。与HG组相比，Res组人肾小球系膜细胞中的hsa-miR-4689-3p与hsa-miR-4741-3p的相对表达量明显升高，其结果与本研究前期microRNA芯片一致，结果见图1。

图1 hsa-miR-4689-3p与hsa-miR-4741-3p的相对表达量

2.2 microRNA的靶基因预测结合前期microRNA芯片与real-time PCR的实验结果，对hsa-miR-4689-3p与hsa-miR-4741-3p进行靶基因预测。MiRanda与TargetScan两个数据库两个microRNA靶基因预测数据库得到的靶基因取交集之后，发现hsa-miR-4689有OPA3,HCN4,HPSE等75个靶基因，其中与DN密切相关的靶基因有FASN、PAX2、PTPN5、ANGPT2等，hsa-miR-4741有CILP2,MMAB,POR等53个靶基因，其中与DN密切相关的靶基因有CD4、PLVAP、GAS2L1、SMURF1、KDM4B、SERPINA3、CACNA1C、DDR1等,如表2所示。

表2 hsa-miR-4689-3p和hsa-miR-4741-3p与DN密切相关靶基因

2.3 GO功能富集分析结果

对 hsa-miR-4689-3p与hsa-miR-4741-3p靶基因进行GO功能富集分析，发现hsa-miR-4689-3p的靶基因与细胞外基质组织功能、细胞增殖负调控、离子跨膜运输、蛋白质结合、T细胞激活、脂质分解、膜电位调节、血管生成、氯离子通道调节等生物学功能密切相关；hsa-miR-4741-3p的靶基因与细胞外基质组织功能、酶结合、蛋白激酶结合、响应钾离子等生物学功能密切相关。

3 讨论

目前已有研究表明白藜芦醇基于其抗氧化应激、抗自噬和抗炎症等效果对DN有一定的防治效果，且对相关microRNA具有一定的调节作用[10-13]。我们的前期研究发现：高糖环境培养MCs可诱导其异常增殖，白藜芦醇对高糖下MCs有显著的抑制作用，能够改善高糖引起的MCs过度增殖。

microRNA的发现为糖尿病肾病机制的研究与防治方法的探寻带来了新思路。本研究从microRNA表达水平的角度，探讨白藜芦醇对MCs的保护作用的可能机制，为其更好的用于治疗DN提供良好的理论基础。本研究中，real-time PCR的结果显示，经白藜芦醇处理的高糖条件下MCs中hsa-miR-4689-3p与hsa-miR-4741-3p的表达水平显著上调，而两者在HG组中呈现低表达。这与我们前期的芯片结果一致，我们推测白藜芦醇可能通过调节hsa-miR-4689-3p与hsa-miR-4741-3p的表达起到对MCs的保护作用。

靶基因预测结果发现hsa-miR-4689有OPA3,HCN4,HPSE等75个靶基因，hsa-miR-4741有CILP2,MMAB,POR等53个靶基因，功能涉及范围十分广泛，包括细胞增殖，分化，血管生成，信号转导等许多方面。其中hsa-miR-4689的靶基因FASN已被验证在DN的小鼠肾脏中异常上调，并且FASN的高表达可通过导致肾小球硬化来加重糖尿病肾损伤[14]； PTPN5被检测到在糖尿病小鼠的肾组织中高表达，且利用刺参酶解物下调PTPN5后，显示出较好的降糖效果[15]；ANGPT2 可在高糖下协同诱导系膜细胞凋亡，且通过抑制miR-33-5p来启动凋亡程序[16]。hsa-miR-4741的靶基因CD4编码 T 淋巴细胞的 CD4 膜糖蛋白，DN下血清中CD4的表达异常下调，从而导致DN患者免疫功能低下[17]；PLVAP 是一种完整的跨膜糖蛋白，其在正常小鼠的肾小球中表达呈阴性，但随着糖尿病肾小球病变程度的加深，PLVAP的表达逐渐上调，表明PLVAP 可作为糖尿病肾小球病变的潜在标志物[18]； SMURF1是Smad 泛素化调节因子-1，在高糖诱导的肾小球系膜细胞中表达增加，并可通过抑制Nrf2/ARE 信号通路的激活诱导糖尿病肾衰竭的发生与发展[19]； DDR1 是一种胶原蛋白受体，可与Ⅳ型胶原蛋白结合，并且在肾脏中高度表达，尤其是在肾损伤时,通过其在胶原蛋白结合中的作用，DDR1已被建议作为肾脏疾病的可能治疗靶点[20]。

综上所述，本研究表明白藜芦醇对高糖下MCs的多种microRNA有调控作用；每一个microRNA都对应着多个靶基因。白藜芦醇对高糖下MCs的保护作用可能部分通过调节hsa-miR-4689-3p与hsa-miR-4741-3p实现。对于hsa-miR-4689-3p和hsa-miR-4741-3p与DN密切相关的靶基因及相关信号通路将是我们进一步研究的课题。