胡椒碱调控STAT3信号通路抑制胃癌的机制研究

陈 镝， 陈美玲， 刘瀚予， 姜 怡， 白芙婷， 郭宇航，朱隆基， 武晓慧， Rajiv Kumar Jha*

(1.西安医学院 基础医学部， 陕西 西安 710021; 2.西安医学院 临床医学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

胃癌已成为我国常见的恶性癌症，全世界约44%的胃癌病例发生在我国，晚期胃癌患者的5年生存率低于10%[1].化疗仍是当前晚期胃癌的主要治疗方案，然而化疗的副作用以及用药过程产生的耐药问题严重影响了化疗效果[2].

近年来，天然生物碱因其良好的抗癌活性以及较低的副作用引起人们的研究兴趣.胡椒碱是分离自黑胡椒科植物的一种天然生物碱，具有广泛的药理活性，包括抗增殖、抗肿瘤、抗血管生成、抗氧化、抗糖尿病、抗肥胖、心脏保护、抗菌、抗衰老和免疫调节等[3].前期研究发现，胡椒碱对胰腺癌、乳腺癌、胃癌等多种癌细胞显示出抑制增殖的作用[4-6].此外，胡椒碱可通过不同信号通路诱导胃癌细胞凋亡，包括Bax/Bcl、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等，而胡椒碱对STAT3信号通路的调控作用则研究甚少[6-8].

STAT3是信号转导与转录活化蛋白(STATs)家族的重要成员，在多种类型癌组织中异常表达，参与调控癌细胞的增殖、分化、凋亡和耐药，已被确认为癌症治疗的关键靶点[9,10].尽管目前已开发出一些针对STAT3的特异性小分子抑制剂，但由于抗癌活性和安全性等原因尚未进入临床应用[11,12].因此，寻找新的具有良好活性和安全性的STAT3抑制剂仍是重要的研究方向.

本研究拟通过检测胡椒碱在体外和体内水平抑制胃癌细胞增殖的能力及其调控STAT3信号通路相关蛋白的方式，初步阐明胡椒碱通过抑制STAT3信号通路而抑制胃癌的分子机制，为胡椒碱进入胃癌临床研究提供了理论依据.

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人胃癌细胞AGS，西安医学院李科副教授惠赠；DMEM高糖培养基，美国GIBCO公司；胎牛血清，美国GIBCO公司；胡椒碱，美国APExBIO公司；裸鼠，北京华阜康生物科技股份有限公司；DMSO，美国Sigma公司；MTT，美国MP公司；Annexin V-FITC/PI双染试剂盒，美国BD公司；BCA蛋白定量试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；一抗(β-actin、STAT3、p-STAT3、Survivin)，美国CST公司；二抗，上海碧云天生物技术有限公司.

1.2 主要仪器

Epoch酶标仪，美国BioTek公司；Accuri C6流式细胞仪，美国BD公司；Mini Pro TEAN Tera cell电泳仪，美国BIO-RAD公司；Chemi Doc凝胶成像系统，美国BIO-RAD公司.

1.3 实验方法

1.3.1 细胞增殖实验

取对数生长期的人胃癌AGS细胞，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液重悬细胞至3×103细胞/孔，接种于96孔板中，每孔100μL.过夜孵育后，每孔分别加入不同浓度的胡椒碱，每个药物浓度组设3复孔，同时设置DMSO阴性对照组.处理24 h、48 h、72 h后，吸去含药培养液，再向每孔加入100μL MTT工作液，继续培养4 h.吸去MTT工作液，再向每孔加入100μL DMSO，振荡至完全溶解.用酶标仪检测490 nm波长处各孔的吸光值，并计算细胞存活率及半数抑制浓度(IC50).

(1)

1.3.2 细胞凋亡实验

取对数生长期人胃癌AGS细胞，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液重悬细胞至2×105/孔，接种于12孔板，每孔2 mL.过夜孵育后，每孔分别加入不同浓度的胡椒碱处理.处理48 h后，消化收集各孔细胞，重悬于100μL缓冲液中.每管分别加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，混匀后室温避光反应15 min.用流式细胞仪检测细胞凋亡率.

1.3.3 蛋白免疫印迹实验

取对数生长期人胃癌AGS细胞，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液重悬细胞至6×105/孔，接种于6孔板，每孔3 mL.过夜孵育后，每孔分别加入不同浓度的胡椒碱处理.处理48 h后，消化收集各孔细胞，重悬于100μL蛋白裂解液中，冰上裂解30 min.在4 ℃环境下以12 000 rpm离心20 min，收集上清即为总蛋白.采用BCA法检测各组蛋白浓度.通过SDS-PAGE和湿转，将各组蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上.以5%脱脂牛奶室温封闭1 h，之后分别与特异性的一抗和HRP标记的二抗孵育.最后用化学发光液孵育，并以凝胶成像仪检测灰度值.

1.3.4 裸鼠荷瘤实验

雄性5周龄裸鼠饲养于西安医学院SPF级动物饲养单元中.采用皮下注射方法，将100μL AGS细胞悬液(5×106)接种于裸鼠右后侧皮下.当肿瘤体积达到约50 mm3时，将裸鼠随机分为两组，即对照组和实验组.每天以腹腔注射给药，对照组注射100μL PBS，实验组注射100μL胡椒碱(10 mg/kg).每天记录裸鼠体重，并以游标卡尺测量肿瘤的长径和短径、计算肿瘤体积.肿瘤体积=(长径×短径2)/2.给药结束后，处死裸鼠，取出肿瘤称重并提取蛋白.

1.3.5 统计分析

数据以均数±标准差表示，所有统计分析均采用GraphPad Prism软件处理，通过ANOVA对多组间差异进行统计学分析，当p<0.05时认为差异具有统计学意义.

2 结果与讨论

2.1 胡椒碱抑制胃癌细胞增殖

通过MTT实验检测胡椒碱在不同作用时间下抑制胃癌细胞增殖的能力.以25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L胡椒碱分别处理AGS胃癌细胞，分别于24 h、48 h、72 h后进行检测.胡椒碱抑制AGS细胞的IC50分别为188.0±5.2μmol/L (24 h)、167.6±8.6μmol/L (48 h)和138.8±7.0μmol/L (72 h).

如图1所示，在同一时间作用下，随着胡椒碱浓度的升高，胃癌细胞存活率逐渐降低；在同一药物浓度作用下，随着时间的延长，胃癌细胞存活率明显降低.即胡椒碱以剂量依赖性和时间依赖性的方式抑制AGS胃癌细胞增殖，这与Lai等在乳腺癌细胞中的研究结论一致[13].胡椒碱抑制胃癌细胞增殖的作用显示出量-效关系和时-效关系，表明胡椒碱具有成为抗癌药物的潜力.

图1 胡椒碱抑制胃癌细胞增殖的作用

2.2 胡椒碱诱导胃癌细胞凋亡

通过细胞凋亡实验检测胡椒碱诱导胃癌细胞凋亡的能力.以50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L胡椒碱分别处理AGS胃癌细胞48 h，以Annexin V-FITC/PI进行双染，并用流式细胞仪检测.0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L胡椒碱诱导胃癌细胞的总凋亡率分别为6.3±0.6%、7.1±0.9%、12.3±3.0%、17.4±2.9%.

如图2所示，胡椒碱的浓度与胃癌细胞的总凋亡率总体呈正相关.其中50μmol/L胡椒碱诱导胃癌细胞的总凋亡率与对照组相比无显著性差异，100μmol/L、150μmol/L胡椒碱诱导的总凋亡率显著高于对照组(*p<0.05,**p<0.01).

诱导癌细胞凋亡的能力是考察药物分子抗癌活性的重要指标[14].上述结果表明，胡椒碱需在中、高浓度作用下才能显著诱导胃癌细胞凋亡，表明其单独使用时抗癌效果有限，这与Chen等在胃癌细胞中的研究结论一致[8].因此，在未来抗癌药物的研究中需要使用高剂量的胡椒碱，同时应关注高剂量胡椒碱使用的安全性.

(a)细胞凋亡检测结果

2.3 胡椒碱抑制胃癌细胞STAT3通路的活化

通过蛋白免疫印迹实验检测胡椒碱调控STAT3信号通路的作用.以50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L的胡椒碱分别处理AGS胃癌细胞24 h后，提取总蛋白，并以western blot法检测STAT3信号通路相关分子的表达.

如图3所示，不同浓度胡椒碱作用下，STAT3的表达量无显著变化.而随着胡椒碱浓度的升高，p-STAT3的表达量逐渐降低，其中100μmol/L和150μmol/L胡椒碱的p-STAT3表达显著低于对照组(*p<0.05,**p<0.01).此外，随着胡椒碱浓度的升高，STAT3通路下游信号分子Survivin的表达量也逐渐降低，其中100和150μmol/L胡椒碱的Survivin表达显著低于对照组(*p<0.05,**p<0.01).

(a)western blot检测结果

研究发现STAT3在癌细胞中持续活化，且能够通过多种途径介导癌细胞耐药，因而成为癌症治疗的关键靶点[15-17].Survivin是STAT3下游的靶基因，在癌组织中高表达，与癌细胞的分化增殖及浸润转移密切相关[18,19].在持续性活化的STAT3调控下，Survivin大量表达并激活抗凋亡作用，造成癌细胞对化疗药物不敏感，导致化疗失败[20-22].因此，抑制STAT3信号通路的活化，是当前抗癌药物研发的重要方向.

上述结果显示，胡椒碱在中、高浓度作用下可显著抑制STAT3的磷酸化并降低Survivin表达.这表明，胡椒碱通过有效抑制STAT3信号通路的活化而降低胃癌细胞的抗凋亡能力，预示其具有改善临床化疗耐药的潜力.

2.4 胡椒碱抑制裸鼠肿瘤生长

由于体外给药时，胡椒碱可直接作用于癌细胞，而体内给药时需经过复杂的代谢环节，具有更多不确定性，因而有必要通过裸鼠荷瘤实验来检测胡椒碱在体内作用时的抗癌效果.

将处于对数生长期的AGS胃癌细胞接种于12只5周龄雄性裸鼠皮下，待肿瘤体积达到约50 mm3时可用于实验.将裸鼠随机分为对照组和胡椒碱组，每天经腹腔分别给予PBS和胡椒碱(10 mg/kg)，并测量裸鼠体重和肿瘤体积.给药9天后，处死裸鼠，取下肿瘤称重并提取蛋白.

如图4所示，给药结束后，对照组肿瘤体积为1 062.4±176.6 mm3，胡椒碱组肿瘤体积为630.1±128.2 mm3，胡椒碱组肿瘤体积显著低于对照组(***p<0.001).对照组肿瘤重量为0.56±0.09 g，胡椒碱组肿瘤重量为0.35±0.06 g，胡椒碱组肿瘤重量也显著低于对照组(***p<0.001).给药期间，对照组和胡椒碱组的裸鼠体重均有所上升，两组间无显著性差异.

上述结果显示，胡椒碱可有效抑制裸鼠体内胃癌细胞增殖，在给药周期内可减小肿瘤体积并降低肿瘤重量，这与Greenshields等在胡椒碱抑制乳腺癌增殖研究中的结论一致[5].此外，体重数据表明该剂量的胡椒碱未产生明显毒性，因而显示出良好的体内安全性.

(a)裸鼠肿瘤照片

2.5 胡椒碱抑制裸鼠肿瘤STAT3的磷酸化

通过蛋白免疫印迹实验检测胡椒碱抑制裸鼠体内肿瘤增殖的分子机制.提取裸鼠肿瘤组织的总蛋白，并以western blot法检测对照组和胡椒碱组肿瘤中p-STAT3和STAT3的表达量.

如图5所示，对照组和胡椒碱组STAT3的表达无显著变化.胡椒碱组p-STAT3的表达显著低于对照组(***p<0.001).上述结果显示，胡椒碱通过抑制裸鼠肿瘤中STAT3的活化而阻止癌细胞逃避凋亡，最终实现抑制肿瘤增殖的作用.这与体外实验结果相吻合，证实了胡椒碱通过调控STAT3信号通路而有效抑制胃癌细胞在体外和体内的增殖.胡椒碱抑制STAT3信号通路中关键分子活化的作用，表明其具有改善化疗耐药的潜力[8,23].

(a)western blot检测结果

3 结论

本研究通过体外和体内相关实验检测胡椒碱抑制胃癌细胞增殖的作用及其调控STAT3信号通路的分子机制.结果表明，在体外，胡椒碱通过抑制STAT3的磷酸化而诱导胃癌细胞凋亡；在体内，胡椒碱通过抑制STAT3的磷酸化而抑制裸鼠肿瘤增殖.本研究初步阐明胡椒碱抗胃癌的作用机制，胡椒碱对STAT3信号通路的调控作用预示其有望成为新的胃癌辅助药物，从而为胃癌的联合用药提供新思路.