单克隆抗体制备技术最新研究进展

武荣飞，杨 溢，王鹏志，原志伟，朱国强*

（1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；3.教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009；4.中华人民共和国威海海关技术中心，山东 威海 264205）

单克隆抗体（Monoclonal antibody，MAb）是由单一B 细胞克隆产生的针对特异性靶抗原的抗体，主要发挥的生物学功能包括中和抗原、调理细胞吞噬、激活补体以及介导细胞毒作用。MAb 具有结构均一、特异性强、排除与其他蛋白抗原的交叉反应等优势，因此被广泛应用于生物医学基础研究和临床诊断治疗的许多领域。从最早的鼠源性MAb 研发至全人源MAb，新的MAb 制备技术应运而生。目前，应用较为广泛的MAb 技术包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单个B 细胞抗体制备技术（图1）。此外，嵌合抗体技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术、酵母细胞展示技术等也可用于MAb 制备。本文概述了这几种技术平台的原理及应用，旨在为MAb 发展研究提供一定理论参考。

图1 单克隆抗体制备方法

1 杂交瘤技术

1975 年，分 子 生 物 学 家Georges Kohler 和César Milstein 将小鼠骨髓瘤细胞和被绵羊红细胞免疫后的小鼠脾细胞融合，通过筛选，鉴定出特异性杂交瘤细胞株，经克隆化培养后即可产生MAb[1]。该细胞株既能持续分泌特异性抗体，又有条件在体外无限增殖。杂交瘤技术的问世是抗体研发生产的重大技术革命，具有划时代的意义，通过这种方式，可以制备针对绝大多数抗原的MAb。迄今为止，研究者们已经建立众多鼠源性MAb 来诊断和治疗多种人类疾病，如首个治疗性抗体Orthoclone OKT3[2]。

杂交瘤技术的主要流程包括动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选与鉴定、克隆化培养等。该技术的基础是细胞融合，可以使用化学融合（聚乙二醇）、病毒（仙台病毒）或电融合[3]等多种技术来完成。细胞培养过程中，骨髓瘤细胞系因缺乏次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（Hypoxanthine guanine phosphori⁃bosyl transferase，HGPRT），在HAT（H-次黄嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶）培养基中无法利用补救途径合成新的氨基酸而发生凋亡[4-5]。因此，在HAT培养基中，杂交瘤细胞获得了正常脾细胞提供的HG⁃PRT 得以存活，继而被筛选出来。随后，为了生产足够量的MAb，可将杂交瘤通过有限稀释筛选出良好的MAb 特性后，大量培养出稳定的克隆。产生MAb 的克隆可被保存在含有10%二甲基亚砜（DMSO）的90%胎牛血清（FBS）中，冷冻在液氮中以备将来使用。

2 噬菌体展示技术

1985 年Smith 发现丝状噬菌体次要外壳蛋白（PIII）的氨基末端可以被修饰来呈现肽序列，而不影响噬菌体的感染性[6-8]。他利用基因工程技术[9]，将EcoR I 核酸内切酶基因插入PⅢ蛋白中，从而创建了噬菌体展示技术。1990 年，Winter 基于此技术，将不同的外源基因整合到丝状噬菌体中组成文库，文库蛋白同噬菌体外壳蛋白融合展现在噬菌体表面[7-8]，从而可以选择特定的结合剂和亲和力特征，进而将噬菌体展示抗体库应用于抗体的发现和分离。为此，两位科学家被授予2018年诺贝尔化学奖。

噬菌体展示技术作为一种应用广泛的体外抗体筛选技术，在肿瘤[10]和HIV 等病毒感染的诊断、治疗方面具有独特的优势。有研究利用免疫或感染后的动物或人体的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）抽提总RNA，反转录成cDNA[11]后，使用特异性引物扩增整套的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，并进行随机重组形成大容量抗体库。随后，将抗体文库克隆后插入到噬菌体编码外壳蛋白的基因中。同时，利用噬菌体展示技术能将特定分子的基因型和表型相统一的特点[12]，使用特异性抗原筛选高亲和力和高特异性的抗体基因序列，即可得到MAb。展示在噬菌体外壳蛋白上的抗体片段包括Fabs（Fragment antigen bindings）或单链抗体（Single-chain antibody fragment，scFv）[13-16]，Fab 结构相对稳定，且结合能力堪比完整IgG 抗体[17]，而scFv 虽具有免疫原性弱、体内清除快、相对分子质量小等优点，但scFv 易产生自我反应性或失去结合亲和力。

值得一提的是，噬菌体展示技术完全不受动物免疫耐受的限制，允许识别针对免疫原性差的抗原或那些难以使用动物免疫方法获得的抗体（例如，多糖或毒性物质）[13]。该技术仅需获得免疫球蛋白的基因序列，建立噬菌体抗体库，即可筛选出针对靶抗原的特异性抗体，缩短了实验周期并增加了稳定性。截至2020 年，通过噬菌体展示产生的9 种人类抗体药物已经被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗人类疾病[13]。

3 单个B 细胞抗体技术

单个B 细胞抗体技术是一种表达单个抗原特异性B 细胞抗体的基因技术，仅需较少的细胞，即可高效、快速分离出潜在的MAb。此外，与噬菌体展示抗体库的随机配对不同的是，该方法保留了生物介导的重链和轻链可变区的配对[18-19]。然而，目前用此种方法开发的治疗性MAb 还没有被美国FDA 批准用于任何疾病的临床治疗。该技术的主要流程包括：免疫特定抗原；鉴定和分离外周血或淋巴组织中特异性B 细胞；单细胞逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）获取抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因并克隆；在真核系统中表达抗体；抗体的纯化及其特性的鉴定。

3.1 单个B 细胞的鉴定和分离 根据研究应用的不同，单个B 细胞的分离可分为随机分选或抗原选择性分选两种途径[20]。随机分离仅需分离B 细胞，操作相对简单，适用于抗原特异性抗体浓度较高的情况。可以通过显微操作法[21]、激光捕获显微切割法[20]和荧光激活细胞分选法[22-25]将单个B 细胞从外周血单个核细胞或者淋巴组织中分离出来。为获得更多特异性抗体，可先通过密度梯度离心法进行粗提[13]。基于B 细胞在不同发育阶段表达的特异性细胞表面标志物不同，荧光激活细胞分选法更广泛地应用于分离单个B 细胞。该方法以流式细胞仪[26]和荧光剂为基础，可以根据细胞的发育和分化阶段快速且精确地区分待分选细胞，尤其是在稀有和离散的B 细胞亚群鉴定中发挥重要作用。

抗原选择性分选则需在Ig 基因克隆前有效地筛选鉴定出具有所需特异性的B 细胞，故而操作相对复杂。血样中含有浓度较低的自身免疫抗体和抗肿瘤抗体等特异性抗体时较为适用。该类分选常用的方法有：荧光包被抗原多参数细胞分离法[27]、微雕法、细胞微阵列芯片法和抗原包被磁珠分离法[28]。这些技术简化了多种抗原的筛选，允许选择具有不同特异性的不同克隆。其中，微雕法尤为特别。其基本流程包括数万个多克隆B 细胞在有丝分裂原刺激下发育成抗体分泌细胞后，被单独沉积到芯片上的微孔阵列中；用该阵列来打印相应的蛋白质阵列，由此每个元素包含由单个B 细胞分泌的抗体；用荧光标记抗原筛选微阵列上的抗体，并将其映射到相应细胞中；通过显微操作手动取出这些细胞，即可通过克隆扩增或RT-PCR 进行分析。

3.2 单个B 细胞克隆及抗体筛选 分选出单个B 细胞后，利用套式或半套式RT-PCR 来扩增每个Ig 重链及相应轻链可变区。为避免非特异性扩增，该过程可使用嵌套引物或引物混合物来增加敏感性和特异性，且能保证扩增出完整的抗体基因序列。一般来说，正向引物针对IgH 和IgL 可变前导序列，反向引物与Ig 恒定区特异性互补[29]。通过优化不同的引物组合，可以提高轻链重链可变区的回收率。随后，携带这些抗体基因的表达载体在相应系统中表达产生重组MAb 后，需进行纯化和各种检测，鉴定其反应性特征和生物物理特性。最常见的表达系统包括细菌系统（如大肠杆菌等）和哺乳动物细胞系（如HEK293 和CHO 细胞系等）[30]。在大肠杆菌中克隆的Ig 基因通常以抗原结合片段（Fabs）的形式表达，而在哺乳动物细胞中的表达可以是完全IgG 形式，更利于抗体的加工修饰，且表达的抗体生物活性更高。迄今为止，一些先进技术已被应用于抗体筛选，包括高通量机器人筛查、下一代测序和单细胞测序[31]等，从而有效促进了MAb 的开发进程。

4 其他MAb 制备技术

4.1 嵌合抗体技术 由于鼠源性MAb 在治疗用途中，容易受到人体针对异源蛋白的不良免疫反应，诱导产生人抗鼠抗体（Hunam anti-mouse antibody，HAMA）[32-35]。因此，为了克服免疫原性和有效性降低的问题，使鼠源性抗体的治疗性使用成为可能，人们开发了嵌合抗体技术，将鼠源性抗体的可变区序列与人抗体的恒定区序列结合起来，插入载体后，对宿主细胞表达的抗体分子进行转染。人鼠嵌合抗体是利用基因重组技术，将啮齿动物抗体转化为更类似于人类抗体的结构，而不会损失MAb Fab片段的结合特性与亲和力。第一个嵌合抗体，抗血小板糖蛋白IIb/IIIa 结合片段的Abciximab 阿昔MAb，于1994 年被美国FDA 批准用于抑制心血管疾病中的血小板聚集[34]。

此外，在人鼠嵌合抗体基础上，通过互补决定区（Complementarity-determining region，CDR）移植技术建立了人源化抗体[35-37]。CDR 存在于抗体的可变区，是抗体识别和结合抗原的区域。在得到针对某抗原的小鼠抗体后，仅取其CDR 序列移植到人抗体中，即可保持靶标的特异性。这种人源化抗体中人源序列可占90%[37]，能够极大减少HAMA 反应。然而，由于抗体中依然存在部分鼠源序列，人源化MAb 中免疫排斥的风险依然不能完全避免。

4.2 转基因小鼠技术 1989 年，通过噬菌体展示和转基因小鼠两种平行的技术生产出第一批完全人源性MAb[38]。转基因小鼠技术是通过基因改造，将人类免疫球蛋白基因插入到小鼠基因组中，取代其内源性抗体基因，并在小鼠淋巴细胞内进行人抗体可变区基因的重排和表达。此时，再根据免疫方案的不同，通过进一步选择免疫转基因小鼠产生的杂交瘤克隆，可以获得高亲和力和抗原特异性的人类MAb[39-41]。2006 年，美国FDA 批准了第一个在转基因小鼠中产生的针对抗表皮生长因子受体的人类抗体Panitumumab[42-43]。与其他人类抗体生产技术相比，转基因动物具有稳定性、无需人源化、体内亲和力成熟和克隆选择多样性等优点。

4.3 核糖体展示技术 核糖体展示技术是一个无细胞的平台，最早由Plückthun 实验室提出，将免疫细胞cDNA 中的轻重链可变区扩增后构建文库，再进行体外转录、翻译[44]。由于构建模板时3'端序列不含终止密码子，核糖体会在体外翻译阶段停留于mRNA的3'端，致使正确折叠的蛋白及其mRNA 同时结合在核糖体上，形成mRNA-核糖体-蛋白质复合物。随后利用抗原-抗体特异性选出所需抗体复合物，并通过EDTA 解离释放出特异性mRNA 后，通过RTPCR 进行扩增。最终，基于亲和力选择和PCR 扩增的迭代循环被用于从变体库中富集亲和力提高的蛋白质[45-46]，从而获得高亲和力的抗体。与传统筛选技术相比，核糖体展示技术易于构建大量点突变体文库，且具有库容量大、筛选方法简便快速等优势。但是，如何进一步提高该系统的稳定性，形成稳固的抗体复合物，也是该技术需要解决的关键问题。

4.4 酵母展示技术 酵母展示技术自1997 年首次应用于抗体工程以来，已被证明是分离和设计抗体片段的一种通用、定量的方法。该技术被应用于抗体亲和力成熟和scFv 库、Fab 库、IgG 库等抗体片段文库的筛选构建[47-48]等方面，并取得较高成功率。一方面，酵母展示的优点体现于所展示抗体片段的质量。酵母文库利用真核生物翻译后进行修饰，以类似哺乳动物细胞的方式显示单链抗体或Fab。由于酵母菌含锚定蛋白、凝集素和絮凝剂[49-50]，在蛋白质折叠和分泌机制等方面与高等哺乳动物相似，该技术能够提高展示抗体的稳定性和抗原结合能力。另一方面，酵母展示最直接的优点是在荧光激活细胞筛选（FACS）过程中对选择参数的精确控制[51]。与噬菌体相比，该技术不仅可以很容易构建各种文库，而且可使用流式细胞术分析对候选克隆进行实时定量的评估，实现高效快速分离和评估。换句话说，在酵母文库选择过程中，这种对所需结合特性的系统性选择在噬菌体文库中是不可用的。

5 小结与展望

随着技术的不断发展和完善，MAb 已经从鼠源抗体发展至完全人源抗体，并在免疫原性和安全性方面均有显著提高。当前，研究者已开发出多种MAb 制备技术，其中，单个B 细胞抗体技术因能快速制备出高特异性、高亲和力的人源化或全人源MAb 而受到密切关注，但也存在许多挑战，如抗原标记技术、分选抗原的配置以及引物组的设计都是成功制备MAb 的重要因素。同时，其他经典的制备技术依旧被广泛应用。杂交瘤技术凭借其成本低、操作性好及临床诊断等优势，仍是实验室制备MAb的首选技术。目前，笔者所在实验室利用前期开发的惰性载体平台，展开MAb 制备的创新研究。该惰性载体能够携带单一外源靶标抗原刺激机体产生针对该抗原的特异性抗体，可直接作为免疫原直接免疫实验动物（小鼠）。利用该平台，本实验室已成功制备和筛选出针对D 群沙门氏菌的凝集性MAb，经验证，其敏感性高、特异性好（数据未发表）。该方法中惰性载体具备颗粒性抗原功能和作为佐剂作用，也不需要抽提或原核表达相应的抗原，大大缩减了MAb 的制备程序和针对性提高MAb 筛选效率，同时，该MAb 的开发为D 群沙门氏菌感染的快速特异性诊断提供了实验和技术基础。而与传统杂交瘤技术相比，噬菌体展示技术无需细胞融合步骤，且不受机体内环境和免疫程序的限制，是抗体人源化应用的主要实验技术，但在增加抗体库多样性以及提高抗体亲和力等方面还有待改进。同样，随着MAb 技术的不断创新，治疗性MAb 药物的安全性成为人们更加关注的问题，未来MAb 技术和MAb 的临床应用也将面临更大挑战。