传染性支气管炎病毒山西分离株的分离鉴定及其S1基因分子特征分析

王旭贞，程 宇，谭仕明，马海利*，梁立滨*

（1.山西省畜牧兽医学校，山西 太原 030024；2.山西农业大学动物医学学院，山西 太谷 030801）

禽传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是由IB 病毒（IBV）引起的一种鸡急性、高度传染性疾病。IB 临床表现为产蛋率及产蛋品质下降、上呼吸道症状、肾炎等，对养鸡业的危害较大。该病最早于1931 年在美国北达科他州发现[1]，1972 年我国广东地区首次报道该病，目前该病在全世界广泛流行[2-3]。

IBV为冠状病毒科γ-冠状病毒属单股正链RNA病毒，基因组全长约27.6 kb，基因组3'端编码的结构蛋白包括刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）及核衣壳蛋白（N）；编码的非结构蛋白包括3a、3b、5a 和5b 蛋白。其中刺突S 蛋白全长1 145 个氨基酸，在感染的宿主细胞内可以被切割成S1 和S2 两个亚基， S1 蛋白含有病毒特异性中和表位，是病毒的主要免疫原性蛋白，目前研究表明在全病毒基因组中S1 基因的变异率最高，发生在S1 基因的突变及重组事件对于IBV 新的基因型、血清型及突变株的出现起决定性作用[4-5]。目前，基于全长S1 基因的进化分析，IBV 可以分为7 个不同基因型，36 个分支，包括GI-1～GI-29、GII-1、GII-2 及GIII-1～GVII-1[6-8]。IB 的防控主要依赖于疫苗的应用（包括减毒苗及灭活苗），但由于IBV 极易发生变异及重组产生抗原变异株，从而常引起疫苗免疫失败。

2021 年5 月山西省晋中市某肉鸡养殖场22 日龄肉鸡突然大量发病，肉鸡采食量降低、咳嗽、甩头、弓背扎堆并排白色水样稀粪，发生疑似鸡IB 疫情，本研究采集发病鸡气管、肺脏及肾脏等病料样品接种SPF 鸡胚进行病毒的分离与鉴定，并对其S1基因序列进行测序与分析，以期为本地区IBV 疫苗选择及IB 疫情防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 疑似感染IBV 鸡的气管、肺脏、肾脏等脏器样品采集自山西省晋中市某肉鸡场。SPF 鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术（北京）有限公司。病毒RNA 提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；ReverTra Ace®qPCR RT Kit 购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；2×RapidTaqMaster Mix 购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；核酸纯化及胶回收试剂盒购自Axygen 公司；DL 2000 DNA Marker 购自TaKaRa 有限公司。

1.2 病鸡剖检观察与病毒分离 将发病鸡及死亡鸡剖检，观察各器官病变情况。将采集的发病鸡气管、肺脏及肾脏加入无菌PBS 研磨，将研磨液4 ℃，8 000 r/min 离心10 min 后的上清用0.22 μm 滤器过滤除菌，以0.2 mL/枚接种SPF 鸡胚尿囊腔，每个脏器研磨液接种3 枚SPF 胚。接种后的鸡胚于37 ℃孵育，弃去24 h 内死亡的鸡胚，无菌收取72 h 死亡鸡胚的尿囊液进行后续鉴定。

1.3 禽呼吸道病毒RT-PCR 鉴定及血凝试验 利用病毒RNA 提取试剂盒提取1.2 中尿囊液RNA，反转录制备cDNA 并作为模板，采用文献[9]中RT-PCR 方法鉴定几种常见禽呼吸道病毒，包括禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）及IBV。同时将收集的尿囊液在SPF 鸡胚上传代。以常规方法制备1% 的SPF鸡外周血红细胞，将收集的鸡胚尿囊液进行血凝试验（HA），检测尿囊液中是否含有可以凝集鸡红细胞的病原微生物。

1.4 分离病毒S1 基因的PCR 扩增及序列分析 以1.3 中IBV 鉴 定 阳 性 尿 囊 液 制 备 的cDNA 为 模 板，参考文献[10]中并优化PCR 方法扩增S1 基因，回收扩增片段由上海生工工程技术服务生物有限公司测序。自GenBank 中选取不同基因型IBV 70 株参考毒株，包括GI-1 至GI-29 基因型、GII-1、GIII-1、GIV-1、GV-1 及GVI-1 等基因型，及目前应用的H120、4/91、M41、H52、LDT-3A等疫苗株，首先利用MAFFT 程序进行多重序列比对，进而利用Mega-X软件Maximun Likelihood 方法中的Tamura-Nei model 进行遗传演化分析；将分离株S1 基因序列与常用疫苗株S1 基因序列利用DNAStar 软件中MegAlign 程序进行氨基酸序列比对及同源性分析；将全长S1 基因利用RDP4 软件进行重组分析，检测S1 基因是否存在重组。

2 结果与讨论

2.1 发病商品肉鸡剖检变化 在此次疑似暴发IB 疫情的肉鸡场，随机剖检不同饲养区的10 只鸡（5 只病死鸡、5 只发病鸡），发现主要组织病变损伤位于气管和肾脏，可见气管、支气管内有卡他性分泌物，并且气管黏膜充血，肾脏肿大且小叶突出，符合近年流行的肾型IB 临床病理特征。

感染的IBV 病毒株不同，侵害的器官不同，包括侵害呼吸道（引起咳嗽、气管啰音等）、消化道（引起腺胃病变）、泌尿生殖道（引起肾脏肿大、产蛋率下降）等，从而引起不同的临床症状[9-10]。其中肾型IB可以引起鸡咳嗽、肾脏尿酸盐沉积（“花斑肾”）、产蛋鸡产蛋下降，近年来流行较广。

2.2 禽呼吸道相关病毒RT-PCR 鉴定及血凝试验为了快速鉴定本次疫情的病原，将采集的气管、肺脏、肾脏组织样品接种鸡胚后提取尿囊液RNA，利用RT-PCR 方法鉴定结果显示，除检测到IBV N 基因目的条带（386 bp）外，AIV 及NDV 扩增结果均为阴性（图1）；进一步将上述尿囊液进行血凝试验，结果显示所收集的尿囊液均不能凝集红细胞，进一步排除了NDV、AIV等具有凝血活性的病原。

图1 禽呼吸道疾病相关病原RT-PCR鉴定Fig.1 Identification of potential causative agent of avian severe respiratory disease by RT-PCR

呼吸道病是目前养禽业临床上常见的一种疾病，对养禽业危害严重。多种病原可以引起鸡的呼吸道症状，包括AIV、NDV、IBV 及支原体等，快速鉴定引起呼吸道疾病的病原对疫病的迅速防控具有重要意义，目前临床上广泛应用PCR方法对禽呼吸道疾病的快速诊断[7,10]，其具有快速、准确、灵敏等优点。

2.3 分离株全长S1 基因扩增及遗传演化分析 将鉴定为IBV阳性的样品RNA反转录后为模板，利用S1基因全长引物进行PCR扩增，结果显示扩增出预期大小的全长S1 基因片段（图2）。测序分析结果进一步证实本研究分离到的病原为IBV，命名为CK/Shanxi-01/2021株。

图2 分离病毒全长S1基因的PCR扩增Fig.2 Amplification of full-length S1 gene by PCR

为了进一步研究所分离IBV 的遗传进化关系，将CK/Shanxi-01/2021株和其他基因型代表性株的全长S1基因序列比对及遗传演化分析。Blast 分析结果显示CK/Shanxi-01/2021 与2011 年分离自鸡的一株ck/CH/LHB/111190的同源性最近，为98.97%；序列比对发现分离株与GI-19基因型中LX4及QX两株代表株的同源性分别为95.8%及96.1%；而与目前国内市售疫苗株H120 的 同 源 性 仅 为78.1%, 与 疫 苗 株4/91 同 源 性 为78.7%，与疫苗株LDT3-A 同源性为85.2%。为了系统研究分离株的进化关系及分支类型，参考已发表文献的基因分型[6-7,11]，利用MAFFT 软件进行多重比对，并进行遗传演化分析，构建系统进化树，结果显示，分离株CK/Shanxi-01/2021 与LX4 及QX 株 等IBV 毒株 亲缘关系较近，且均为GI-19 基因型（图3），而与H120、M41、H52、LDT-3A等市售疫苗株亲缘关系较远。将分离株S1 基因与不同基因型代表株序列利用RDP4软件进行重组分析，未发现显著重组现象。

图3 2021年山西IBV分离株全长S1基因与不同基因型参考株相应基因序列的遗传进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of full-length S1 gene of Shanxi/2021 IBV isolate and reference strains from different genotypes

多篇文献报道GI-19基因型（QX-like株）逐渐成为我国目前IBV 流行的主要基因型之一，其他基因型如GI-7（TW-like）、GI-13（4/91-like）及GI-22（YN-like）也经常被分离到[7-8,12-14]。可见在我国流行的IBV株具有基因多样性，多种不同基因型同时流行以及目前IBV弱毒疫苗株的普遍应用，进一步增加了不同IBV 之间发生重组的可能性。这也可能是近年来IB的防控难度加大，导致IB疫情不断出现的原因。

2.4 分离病毒S1 基因高变区（HVR）氨基酸多态性分析 由于IBV 本身基因组特点，在流行过程中极易发生突变或与其他病毒株发生重组产生变异株，从而导致发生新的疫情。其中S1 基因的高变异区突变率较高[7,10,15]，为了进一步分析IBV 分离株CK/Shanxi-01/2021 的分子特征，本研究对其S1 蛋白氨基酸多态性进行了分析，结果显示，该分离株S1 蛋白HVR 区存在多个氨基酸突变，其与原来经典GI-19 基因型病毒株氨基酸序列相比，在高变异区存在V68I、S120A、A271T、N282T、N291S 等突变。

将该分离株S1 基因与目前国内市售IBV 疫苗株H120、4/91、M41、H52 及LDT3-A 株序列比对分析发现，山西分离株S1 基因与IBV 常用疫苗株S1 基因的核苷酸序列同源性为78.1%～85.2%，氨基酸序列的同源性仅为75.2%～78.4%，S1 蛋白已经发生明显变异。与H120 疫苗株相比，分离株S1 蛋白发生S54T、S57T、V68I、H120A、T157R 等突变，这些突变位于S1 蛋白主要受体结合区[16]。该发病肉鸡场中尽管已经免疫H120 疫苗，依然发生IB 疫情，推测是由于流行株抗原变异，而疫苗株免疫保护力不够所致。因此，为有效防控IB 疫情，必须进一步加强IBV 流行病学监测工作，及早发现IBV 变异株，为科学合理防控策略的制定提供参考依据。