延边地区牛病毒性腹泻病毒YBHC株的分离鉴定与遗传进化分析

陈 姗，马浩原，付兢锋，李 强，李香子，高 旭

（延边大学农学院动物医学系，吉林 延吉 133000）

牛病毒性腹泻/粘膜病（Bovine viral diarrhea-mu⁃cosal disease，BVD-MD）是由BVD 病毒（BVDV）引起的一种牛及其他反刍动物出现呼吸道疾病、腹泻、胎儿先天畸形和生殖障碍的传染病[1-2]，呈全世界范围分布。BVDV 可穿过妊娠前3 个月的母牛胎盘，致使其所生犊牛永久性感染，并生长发育为持续感染（PI）犊牛，终生持续排出大量病毒，导致病毒无法净化而使疫情蔓延，严重制约了养牛业发展，给牛产业造成重大经济损失[3]。BVDV 属黄病毒科，瘟病毒属，单股正链RNA 病毒，基因组全长约12.3 kb，其包括5'端非翻译区（5'UTR）、一个编码区开放阅读框（ORF）和3'端非翻译区（3'UTR），其中5'UTR 高度保守，常用于分离病毒的基因型鉴定[4]。根据5'UTR等基因可将BVDV 分为3 种基因型，即BVDV-1 型、BVDV-2 型和BVDV-3 型，其中BVDV-1 型又分为21个亚基因型（1a-1u），我国以BVDV-1b 和BVDV-1m两个亚型流行为主[5]。

吉林省延边朝鲜族自治州是中国5 大地方良种牛之一—延边黄牛的产地，与俄罗斯和北朝鲜毗邻，拥有广阔的草原牧场，但由于存在地处三国交界的复杂地理因素，加之放牧饲养的不可控因素，近年来使延边黄牛严重腹泻病例多点发生并呈现蔓延趋势，严重制约了延边黄牛产业的发展。另外延边朝鲜族自治州有11 个对朝、对俄口岸，口岸过货量占吉林省的90%以上，近年来畜产品进出口贸易也逐渐增多，因此对该地区动物传染病调查分析十分必要。2021 年3 月吉林省延边朝鲜族自治州珲春市某牛场的犊牛出现了严重腹泻，此前该地区未见关于BVDV 感染的报道。因此，本研究采集延边地区规模化养牛场患病犊牛的粪便样品，经分离鉴定后为BVDV 感染，并进一步对分离株进行了遗传进化分析和电镜观察，为延边地区BVD 疫情的防控和疫苗研制提供物质基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 犊牛粪便样品采集自吉林省延边朝鲜族自治州规模化养牛场疑似BVDV 感染犊牛。MDBK细胞由延边大学预防兽医实验室保存。MEM细胞培养液和胎牛血清购自GIBCO 公司；DL1000 DNA Marker、PrimeScript RT reagent kit、pMD18-T 载体 购自TaKaRa 公司；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒以及100 ku 中空纤维柱购自Omega 公司。

1.2 引物设计 参考GenBank中登录的BVDV-5'UTR基因序列（GQ985457），设计一对特异引物BVDV-F：5'-ATGCCCWTAGTAGGACTAGCA-3'/BVDV-R：5'-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3'，预期扩增的目的基因为288 bp，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.3 细胞培养与病毒分离 将粪便样品按照常规方法处理后接种细胞丰度达到80%以上的MDBK 细胞，孵育1 h 后加入含有10% FBS 的MEM 细胞培养液，继续培养72 h 后收获细胞培养物，经反复冻融3次后继续传代5 代，观察细胞病变（CPE），同时设置MDBK 细胞作为空白对照。采用TRIzol 抽提方法提取盲传至第5 代细胞培养物RNA，反转录为cDNA 后作为模板，以BVDV-F/R 为引物进行PCR 鉴定，退火温度为56 ℃。

1.4 5'UTR 基因的PCR 扩增及遗传进化分析 将1.3 中PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收纯化产物TA 克隆，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞后利用质粒小提试剂盒提取质粒，按照1.3 中PCR 方法鉴定为阳性的质粒送由长春库美生物公司测序。参照GenBank 中相关序列，利用DNAStar 软件对BVDV 5'UTR 测序结果比对和遗传进化分析。

1.5 病毒电镜观察 对RT-PCR 鉴定为BVDV 阳性的细胞培养物继续传2 代，即传至第7 代时取5 mL培养液经8 000 r/min 离心10 min 后，反复冻融3 次，上清液经0.22 μm 滤膜过滤后以100 ku 中空纤维柱对病毒液浓缩后，戊二醛固定1 h，再用2%磷钨酸负染，利用透射电镜观察病毒粒子大小及形态。

2 结果与讨论

2.1 病毒的分离与鉴定 粪便样品提取物接种于MDBK 细胞后观察可见，盲传第5代的细胞培养24 h～72 h 未出现BVDV 典型的空泡病变（图1B），阴性对照细胞生长状态良好（图1A）；RT-PCR 鉴定结果显示，在约300 bp 处出现一目的条带，与预期大小相符（图1C）。初步表明分离病毒为非细胞病变型（NCP型）BVDV。根据生物型可将BVDV 分为细胞病变型（CP）和NCP 型，CP 型BVDV 感染主要造成消化道损伤，且相对罕见[6]，而NCP 型BVDV 对白细胞、淋巴器官和呼吸道均有嗜性，胎儿在宫内感染NCP 型BVDV 后，除了会引起呼吸道、胃肠道、生殖系统等黏膜病外，还可导致幼畜免疫耐受和持续性感染（PI），这些PI 动物出生后持续释放病毒，形成病毒向易感动物传播的主要途径，这也是BVDV 难以净化的主要原因[7]。结合粪便样品来源的犊牛临诊症状和病理变化，初步判定本研究的BVDV 分离株其为NCP 型。

图1 病毒的分离与鉴定结果（200×）Fig.1 Isolation and identification results of BVDV(200×)

2.2 病毒遗传进化分析结果 进一步对PCR 扩增的5'UTR 测序后比对分析，结果显示其为288 bp（5'UTR OM622422），与GenBank 中 已 登 录BVDV 5'UTR 基因的同源性为73.1%～99.7%，进一步表明分离株为BVDV；遗传进化树分析结果显示，该分离病毒株与BVDV-2、BVDV-3、CSFV、粘膜病病毒（BDV）不在同一分支，亲缘性较远，与BVDV-1 在同一分支，且同源性达98.9%（图2A），表明其属于BVDV-1 型。将分离的BVDV-1 与GenBank 中已登录的18 个BVDV-1 亚型进行同源性分析，结果显示，分离的BVDV-1 与南京株BVDV-1b（MK-059454）、阿根廷株BVDV-1b（MK684385）处于同一分支，表明本研究分离的BVDV 属于1b 亚型（图2B）。将其命名为YBHC 株BVDV-1b。

图2 BVDV遗传进化分析Fig.2 Genetic evolution analysis of BVDV

根据基因型和抗原差异将BVDV 分为BVDV-1 和BVDV-2 两种基因型，其中BVDV-1 之间毒力变异较小，目前已知分离到21 个基因亚型（1a～1u）[8]。我国主要流行BVDV-1b 和BVDV-1m 基因亚型[9-10]。近些年，在欧洲还分离到一种新的BVDV 基因型，即BVDV-3 型，该基因型可分为Thai 源和Brazilian 源两种基因亚型[11-12]。本研究BVDV 分离株经鉴定属于BVDV-1b 亚型，与以往我国流行的常见基因亚型相符，进一步验证国内BVDV 流行株基因型较为稳定。

2.3 电镜鉴定 收集盲传7 代后的细胞培养物浓缩处理后于透射电镜下观察，可见YBHC 株BVDV-1b呈球形的病毒粒子，直径大小为40 nm～60 nm，特征与已报道的BVDV 形态一致（图3）[13]。病毒粒子是成熟的或结构完整、有感染性的病毒个体，本研究YBHC 株BVDV-1b 病毒粒子的获得为其生物学特性等进一步研究，以及疫苗的开发奠定了物质基础。

图3 BVDV病毒粒子电镜观察（Bar=200 nm）Fig.3 Morphological observation of BVDV under electron microscope(Bar=200 nm)

延边朝鲜族自治州地理位置特殊，地方品种延边黄牛饲养量大，近年来其疫病暴发呈地域性、多变性和难控性等特点，黄牛严重腹泻病例多点发生并呈现蔓延趋势，严重制约了延边黄牛产业的发展。本研究首次在延边地区分离到BVDV，并鉴定为BVDV-1b 亚型，这为延边地区BVDV 疫苗的研制及疫情防控提供了地方种毒和参考依据。