冻干保护剂对西番莲酵素粉理化特性菌体活力影响及其益生菌活力评价

张 顺，沈雪玉，黄 苇

（华南农业大学，广东 广州 510642）

0 引言

在前期研究中，以西番莲果皮为对象，通过优化酵母菌、乳酸菌混合发酵工艺，制备出活菌数高、多酚成分保留率高，且风味醇和的果皮浆[1-2]。但制备的果皮浆体积大，常温下极易变质，经干燥处理后更适宜贮运、销售。制备高活力的益生菌酵素粉主要是将益生菌包埋在可溶性微胶囊壁材中，以提高益生菌存活性，目前益生菌粉的主要干燥法有喷雾干燥法和冷冻干燥法[3]。真空冷冻干燥酵素粉中的益生菌存活率和复水后的活性都较高，并且热敏性营养成分损伤小，对发酵浆的香气成分保留好[4-5]。

益生菌活菌数及其活性高低是评价酵素产品的主要指标之一，要获得高质量的益生菌粉，在冻干过程中需要添加对益生菌具有保护作用的保护剂。试验利用冷冻干燥法制备西番莲酵素粉，除加入常规保护剂CMC、麦芽糊精、β -环糊精以外，重点关注了脱脂乳粉和海藻糖的保护作用。益生菌酵素粉在进入人体后，分别经过胃液、肠液、胆汁等消化器官，并最终定植于人体肠道系统发挥生理功能，因此其活性取决于在肠道环境中的活菌数量[6]。研究模拟人体消化环境下益生菌的存活情况，是评价酵素粉质量的重要指标之一。

针对发酵西番莲果皮浆真空冷冻干燥过程中保护剂的应用效果开展研究，并对酵素粉在模拟人体消化环境下益生菌的存活情况进行评价。

1 材料与设备

1.1 材料

发酵西番莲果皮浆（参照张顺等人[1]的方法制得）。其中，复合乳杆菌活菌数为8.93 lg CFU/g，酿酒酵母菌活菌数为7.78 lg CFU/g，总酚含量为24.00 μg/mL，总酸含量为4.40 mg/mL；西番莲，购自广州市天平架水果批发市场。

1.2 主要试剂

脱脂乳粉、蔗糖、葡萄糖等（均为食用级或分析纯），山东祥瑞药业有限公司提供；海藻糖、胰蛋白酶、胆酸盐、胃蛋白酶，上海源聚生物科技有限公司提供；CMC，上海申光化学品有限公司提供；β -环糊精、L -酪氨酸，上海博奥生物科技有限公司提供；麦芽糊精，天津市科密欧化学试剂有限公司提供；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、没食子酸、重铬酸钾，广州化学试剂厂提供；三氯乙酸，永华化学科技（江苏） 有限公司提供；干酪素，北京奥博星生物技术有限责任公司提供。

1.3 菌种

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei subsp. casei），均为本实验室保藏菌种。

1.4 主要培养基

MRS 琼脂培养基、MRS 肉汤培养基、麦芽汁培养基、孟加拉红培养基等，广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.5 试验仪器与设备

JE/T 型电子分析天平，梅特勒-托利多上海仪器有限公司产品；HK-10B 型高速粉碎机，杭州赛旭食品机械有限公司产品；电热鼓风干燥箱、LRH型生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；MJBL25C4 型搅拌机，广东美的生活电器制造有限公司产品；JM-L80 型胶体磨，温州富瑞康机械科技有限公司产品；TGL-16M 型冷冻高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；12ND 型冷冻干燥机，宁波新芝生物技术有限公司产品；DF101S 型磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限公司产品；LDZX-30KBS 型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品；XK97-A 型菌落计数器，邦西仪器科技上海有限公司产品。

1.6 溶液配制

（1） 人工胃液的配制。准确量取浓度1 mol/L 的盐酸溶液20 mL，加蒸馏水调节pH 值，使pH 值达到2~3，然后分别加入胃蛋白酶，加入量按照1∶10（g∶mL） 的质量浓度比计算，充分溶解后过滤除菌，制得人工胃液，备用。

（2） 人工肠液的配制。称取KH2PO43.4 g，加蒸馏水250 mL 溶解，用0.4%的NaOH 溶液调节pH 值至6.8，加水稀释至500 mL，然后按照1∶100（g∶mL） 的质量浓度比加入胰蛋白酶，充分溶解后过滤除菌，制得人工肠液，备用。

2 试验方法

2.1 冻干酵素粉的制备

西番莲果磨皮去角质层→果皮打浆→高压灭菌→酿酒酵母、乳酸菌混合发酵→冻干保护剂调配→均质→真空冷冻干燥→西番莲酵素粉。

2.2 西番莲冻干酵素粉保护剂的筛选

在试验中，选用不同性质的保护剂CMC、麦芽糊精、β -环糊精、脱脂乳粉及海藻糖，并进行配比组合，比较不同组合保护剂对冻干酵素粉活菌数的影响。

不同种类保护剂添加量组合见表1。

表1 不同种类保护剂添加量组合/ g·（100 mL）-1

2.3 西番莲冻干酵素粉的理化特性

2.3.1 冻干酵素粉水分的测定

常压干燥法（质量法），参照GB/T 5009.3—2016 食品安全国家标准食品中水分的测定。

2.3.2 冻干酵素粉还原糖及总糖的测定

3,5 - 二硝基水杨酸比色法，参照GB 5009.7—2016 食品安全国家标准 食品中还原糖的测定，绘制葡萄糖标准吸收曲线。

2.3.3 冻干酵素粉酸度的测定

酸碱滴定法，参照GB/T 12456—2008 食品中总酸的测定。

2.3.4 冻干酵素粉总酚的测定

参照GB/T 8313—2008 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法，绘制没食子酸标准曲线。

2.3.5 冻干酵素粉氯化钠的测定

参照GB 5009.44—2016 食品中氯化物的测定。

2.3.6 冻干酵素粉中活菌数测定

参照GB 4789—2010 中乳酸菌菌落总数的测定方法。

2.4 西番莲冻干酵素粉的生理特性

2.4.1 人工胃液耐受试验

参照艾连中等人[7]报道的方法，取1 g 酵素粉溶解于9 mL 生理盐水中，放入磁力搅拌器37 ℃下水浴加热，待充分溶解后取1 mL 加入4 支装有10 mL人工胃液的试管中，放入培养箱中37 ℃下分别培养0.5，1.0，2.0，3.0 h，待相应时间后取出利用稀释倒平板法进行菌落计数，每组平行试验3 次。

2.4.2 人工肠液耐受试验[8]

取1 g 酵素粉溶解于9 mL 生理盐水中，放入磁力搅拌器37 ℃下水浴加热，待充分溶解后取1 mL加入4 支装有10 mL 人工肠液的试管中，放入培养箱中37 ℃下分别培养0.5，1.0，2.0，3.0 h，在相应时间取出后，利用稀释倒平板法进行菌落计数，每组平行试验3 次。

2.4.3 胆汁耐受力试验

根据卜永士等人[9]报道的方法有所改动。准确称取1.00 g 酵素粉分别溶入9 mL 质量浓度为0，0.3，0.5，1.0，2.0，3.0 g/L 胆酸盐溶液中，在放入磁力搅拌器37 ℃下保温2 h，取出后利用稀释倒平板计数法计算活菌数和存活率。

2.5 数据处理

样品做3 次平行试验，利用WPS office 对试验数据进行整理和处理，利用Origin Pro8 对数据处理作出相关图形。

3 结果与分析

3.1 不同保护剂组合对真空冷冻干燥酵素粉中活菌数影响

在益生菌真空冷冻干燥过程中，CMC 具有较好的菌体保护作用，并能够改善粉体的流动性、溶解度等特性，在此基础上，加入脱脂乳粉和海藻糖，以提高酵素粉中的益生菌存活率。

不同保护剂组合对冷冻干燥活菌数及存活率的影响见图1。

图1 不同保护剂组合对冷冻干燥活菌数及存活率的影响

在未添加冻干保护剂直接干燥的空白对照酵素粉中，益生菌存活率较低，只有62%，而添加了冻干保护剂的组合c，活菌数和存活率较直接干燥的酵素粉a 对照分别提高了34.9%和21.0%，说明加入保护剂后，对酵素粉的益生菌保护效果明显；另外，比较组合b 和c 可以看出，c 组合中将等量的脱脂乳粉换成海藻糖，其活菌数和存活率分别比b 提升了9.8%和8.0%，证明了海藻糖能够保护菌体活力，使之免受干燥过程中的损伤。

3.2 冻干西番莲酵素粉的理化特性结果分析

不同处理方式的冻干西番莲酵素粉见图2，酵素粉一般理化指标测定结果见表2，酵素粉特征性指标测定结果见表3。

图2 不同处理方式的冻干西番莲酵素粉

表2 酵素粉一般理化指标测定结果/%

表3 酵素粉特征性指标测定结果

由图2 可看出，未添加冻干保护剂的酵素粉色泽偏淡黄色，且粉体颗粒大，较为粗糙，西番莲果皮发酵液中纤维成分丰富，因此在干燥后粉体质感较为粗糙。而加入了冻干保护剂的试验组则色泽偏淡，但粉体均匀细腻，没有颗粒感，说明加入的脱脂乳粉、海藻糖等既可作为益生菌保护剂起到保护作用，又可以改善粉体性质。

根据TCBFIA 08001—2016 酵素产品分类导则和团体标准食用植物酵素，将冻干酵素粉中的理化指标分为一般理化指标和特征性指标[10]。从表2 中看出，添加保护剂的试验组和和未添加的空白组，都均未检出乙醇，氯化钠含量均在标准要求范围内；从表3 可知，空白组总酸和总酚含量高于添加了保护剂的试验组，这是因为添加了冻干保护剂的酵素粉中因含有麦芽糊精、脱脂乳粉和海藻糖、总酚和总酸占比下降；同理，添加了海藻糖的冻干酵素粉中，因额外添加的糖使总糖含量高于空白组；而关键性指标、益生菌活菌数方面，添加保护剂的试验组显著高于空白组，其乳酸活菌数达到8.08 lg CFU/g，远高于标准要求的5. 00 lg CFU/g；多酚含量也高于标准要求。

3.3 冻干西番莲酵素粉的模拟消化条件下菌体活力结果分析

3.3.1 酵素粉中益生菌在模拟胃液环境下的存活率结果分析

胃液的酸度极高，通常其pH 值在1~3，在消化食物时会出现波动，这样的酸性环境下大部分微生物都难以存活，食物在人体胃部的停留时间一般在3 h。要保证益生菌能“安全”到达人体肠道而进一步定植，以发挥抑制有害菌群增殖、增强肠道免疫等生理作用，益生菌需要耐受胃液的严苛环境。

模拟胃液环境下的活菌数和存活率变化情况见图3。

图3 模拟胃液环境下的活菌数和存活率变化情况

由图3 可知，在模拟胃液环境下，酵素粉中的活菌数随消化时间延长呈下降趋势，在模拟消化时间0.5 h 时活菌数有8.86 lg CFU/g，存活率达到98%，而在经过3 h 后的胃液消化后活菌数为7.00 lg CFU/g，存活率为77%，说明在模拟胃液环境下，酵素粉中的益生菌能够保持较好的活力，以保证食用后发挥益生菌的功效。

3.3.2 酵素粉中益生菌模拟肠液环境下的存活率结果分析

食物经过胃液的消化后会进入肠道，而肠道内是人体微生物聚集的部位，其种类和数量都很多，包括对人体有益的益生菌和对人体有害的有害菌群。益生菌对小肠液必须具有一定的耐受性才能更好地发挥作用。小肠液的pH 值大约为7.6，无论是固体还是液体食物通过小肠的平均时间约为1.5 h。

模拟肠液环境下的活菌数和存活率变化情况见图4。

图4 模拟肠液环境下的活菌数和存活率变化情况

由图4 可知，在初始消化时间0.5 h 和1.0 h时，活菌数维持在较高水平，无明显下降，达到8.86 lg CFU/g 左右，说明益生菌对模拟肠液的适应性较好；而在消化后期，益生菌活菌数开始下降，在3 h 活菌数对数值还有8.00 lg CFU/g 左右，而存活率也达到88%。即在模拟肠液下，酵素粉中的益生菌在前期3 h 内能够保持在90%的存活率，能够在经过肠液环境后依然能保证较高的存活数，并顺利进入其他消化环境中。

3.3.3 酵素粉中益生菌模拟胆汁环境下的存活性结果分析

人体内的胆汁含有一定胆酸，其质量分数一般为0.3%~3.0%。胆酸盐对微生物具有一定的抑制作用，因此要发挥益生菌在人体肠道定植的作用，对胆酸盐的耐受性也是重要指标。

不同胆酸盐质量分数下的活菌数及存活率变化情况见图5。

图5 不同胆酸盐质量分数下的活菌数及存活率变化情况

由图5 可知，选择模拟胆汁酸的作用时间均为2 h（进餐消化后1~2 h 内的血清胆汁酸水平会急剧升高），在较低质量分数下，酵素粉中的活菌数维持在7.00 lg CFU/g 左右，而在升高胆酸盐质量分数后，益生菌活菌数会迅速下降，在质量分数为3%的高水平时，存活率为64%，活菌数下降为5.78 lg CFU/g，低于益生菌最低发挥作用数量级6.00 lg CFU/g 的要求，但总体看，在胆酸盐质量分数处于非极端条件下的益生菌仍可以维持较高的活性水平。

3.4 讨论

试验中，在CMC、麦芽糊精和β -环糊精基础上，添加了脱脂乳粉和海藻糖，后两者可以明显提高益生菌酵素粉的活性。脱脂乳粉为大分子物质，可在细胞表面形成保护层，以减少细胞暴露在氧气及介质中的面积，从而保护细胞免受损伤，其适用性强，对不同的益生菌类均能起到很好的保护作用；而海藻糖一方面作为非还原性多糖，其含有多个极性较强的亲水羟基，能够在脱水干燥过程中，在菌体细胞表面形成保护膜，保护蛋白质分子不变性失活，其玻璃化温度较高、吸湿性低，很适合作为活性成分干燥保护剂[11-14]。另外，海藻糖作为功能性低聚糖，有研究也表明其可以促进益生菌在体内的增殖，提高人体的免疫力，从而发挥预防肠道疾病的作用[13，15-18]。

4 结论

以真空冷冻干燥法制备西番莲果皮酵素粉，比较了不同干燥保护剂对冻干酵素粉的理化特性、菌体活力的影响，并对模拟消化条件下酵素粉中益生菌活力进行评价，结论如下：

（1） 海藻糖、脱脂乳粉冻干保护剂在西番莲果皮酵素粉冻干过程中，起到了保护益生菌和改善粉体性质的作用。添加了保护剂的酵素粉较直接干燥的酵素粉，其益生菌存活率提高了34.9%，且粉体更加细腻均匀，适合进行后续的保存与应用。

（2） 该条件下生产的冻干酵素粉在模拟人体消化试验中表现出较好的耐受性，胃液消化3 h 后，活菌数7.00 lg CFU/g，存活率为77%；在肠液中3 h 后，活菌数8.00 lg CFU/g，而存活率也达到88%；在中等浓度胆酸盐的模拟胆汁中，活菌数高于6.00 lg CFU/g标准要求。较高的活菌数和存活率保证了益生菌酵素粉进入人体环境后能定植成功，发挥相应的作用。

（3） 该工艺下制得的冻干酵素粉中，虽然益生菌存活性较高，但是总酸和含糖量偏低，产品应用还需要从发酵工艺和后期冻干添加剂上进行优化。同时，试验只对其储存特性进行了初步的验证和分析，对于该益生菌酵素粉的最佳储存方式未做讨论，因此后续还应加强对其储存、包装等性质的研究。