氧化纤维素纳米颗粒稳定的Pickering乳液延缓油脂消化的研究

梁 爽，白 杰，王启蒙，刘 斌，李 媛

（中国农业大学营养与健康系 食品科学与营养工程学院 北京 100193）

20世纪初，Pickering[1]和Ramsden[2]等科学家最早提出Pickering 乳液的定义，即由固体颗粒代替小分子表面活性剂来稳定的乳状液，或称为颗粒型乳状液[3]。相较于传统小分子乳化剂稳定的乳状液，固体颗粒乳状液因具有较高的解吸附自由能和界面膜机械强度以及空间阻碍而更稳定。Pickering 乳液体系具有更高的黏度，有利于改善食品质构[4]。对于水包油型Pickering 乳液，固体颗粒对于内相中油脂的消化具有明显的延缓作用，因此有人将高内相水包油Pickering 乳液应用于低热量的人造奶油[5]。Pickering 乳液作为一个新型的食品乳液体系，在低热量食品的开发中具有广阔的应用前景[6-7]。

目前用来稳定Pickering 乳液的食品来源的固体颗粒主要由蛋白[8-9]、多糖[10]及脂肪[11]等食品大分子构成，比如玉米醇溶蛋白、大豆蛋白，壳聚糖颗粒、纤维素颗粒和脂肪酸晶体等。纤维素是自然界存在最多的大分子多糖聚合物，由于其良好的生物相容性及安全性在食品中广泛应用[12]。通过强酸性气爆处理，去除玉米芯废料里的木质纤维素、木质素和半纤维素便可以得到纤维素。然而，纤维素因具有较强的分子间氢键作用而高度结晶，粒径较大且不溶于水，难以形成稳定的Pickering 乳液。以2，2，6，6-四甲基哌啶氧自由基（2，2，6，6-Tetramylpiperidol oxygen radical，TEMPO）作为催化剂，能使纤维素的碳六位羟基氧化为羧基，实现氧化度的精确控制，从而改变晶体结构，获得亲水性相对增强且粒径减小的纤维素纳米颗粒，最终改善纤维素的结构与性能[13]。作者发现作为稳定剂，氧化纤维素能够更好地稳定油水界面。Kalashnikova 等[14]利用不同来源纤维素研究其稳定Pickering 乳液的能力，结果表明，长度在4～185 mm 范围的纤维素纳米颗粒均能不可逆地吸附在油水界面，形成非常稳定的乳液。Liu 等[15]探究氧化纤维素纳米颗粒形成Pickering 乳液在模拟肠液中的消化特性，结果表明：纤维素纳米颗粒能够阻碍脂质的消化。有研究发现，不同形状的纳米颗粒稳定的Pickering 乳液界面稳定性和界面膜机械强度不同[16]，推测不同形状纳米颗粒稳定的水包油型Pickering 乳液的油脂消化特性也不同。

为更好地探究颗粒形貌对于Pickering 乳液油脂消化的影响，以农业废弃物玉米芯为原材料提取纤维素，采用TEMPO 法获得氧化纤维素纳米颗粒，通过调控氧化工艺获得氧化纤维素纳米球及纳米棒，并制备由氧化纤维素稳定的Pickering乳液。研究不同纤维素颗粒稳定Pickering 乳液的稳定性差异，并探究其对乳液油脂消化的影响，以期为纤维素的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用的氧化纤维素和去离子水均为实验室自制。玉米芯，购自山东禹城，粉碎至20 目。NaBr、NaBH4均为分析纯级，麦克林公司；TEMPO，Sigma公司；盐酸胍，Sigma 公司；罗丹明B，Sigma 公司；醋酸双氧铀，兰博立德公司；KBr，Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

激光共聚焦显微镜，日本尼康A1；透射电子显微镜，日本日立HT7700；原子力显微镜，德国布鲁克RAMII；马尔文激光粒度仪，英国马尔文Nano-series；稳定性分析仪，法国Turbiscan MA2000；冷冻扫描电镜，英国Quorum PP3010T；扫描电子显微镜，日本日立SU9000；接触角测量仪，德国DataPhysics OCA 25；自动电位滴定仪，瑞士Metrohm 907 Titrando；磁力搅拌器，德国Ika RCT B S25。

1.3 方法

1.3.1 纤维素原料的提取 纤维素原料的提取参考Liu 等[17]的方法。用质量分数0.5%的H2SO4在室温下浸泡玉米芯10 h，然后用纱布过滤去除过量的酸溶液。过滤后的玉米芯用蒸汽进行爆破处理。爆破后的玉米芯样品，用水清洗。洗涤后的样品在40 ℃烘箱中烘干，用于纤维素提取。将5 g 气爆玉米芯溶于50 mL 碱溶液中，将反应体系置于反应釜中160 ℃下作用2 h。待反应结束，反应釜冷却至室温后，用体积分数80%的乙醇溶液洗涤抽滤产物，将所得样品置通风橱干燥，获得产物即为气爆玉米芯纤维素。

1.3.2 氧化纤维素的制备 将8.1 g 在1.3.1 节制得的纤维素分散于水中，将溶解好的3.24 g NaBr和0.064 g TEMPO 加入纤维素悬浊液中，调节反应体系pH 值至10。在纤维素的氧化度达到50时，0.5 mol/L NaOH 溶液的使用量控制在50 mL。当定量NaOH 滴完后，加入无水乙醇（10 mL）终止反应。随后加入3.24 g NaBr 充分搅拌1 h。将反应体系pH 值调节至3，继续搅拌1 h，除去多余的NaBr。最终将反应溶液调节为中性，在搅拌状态下加入体系1.5 倍体积的无水乙醇析出氧化纤维素。抽滤得到氧化产物，用无水乙醇抽滤洗涤3次，将所得产物放入通风橱中挥发多余的乙醇，即得到氧化后纤维素[15]。氧化纤维素纳米棒及纳米棒的制备可参考Liu 等[15，17]的方法。

1.3.3 纤维素纳米颗粒的表征

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1.3.3.1 透射电子显微镜表征产物形态 用超纯水将氧化纤维素样品稀释到1 mg/mL，涡旋振荡并超声5 次。取样品10 μL 滴于铜网上，静置5 min 后，用滤纸将多余样品吸走并晾干。用透射电镜（Transmission electron microscope，TEM）观 察样品形态。

1.3.3.2 扫描电子显微镜观察产物表面形态 将不同样品固定在有导电胶的样品台上，喷金处理后将样品置于扫描电子显微镜（Scan electron microscope，SEM）下观察样品形貌。

1.3.3.3 原子力显微镜分析产物形态 将纤维素纳米晶体用超纯水稀释至0.002%（质量分数），取10 μL 样品均匀滴加到云母片上，并将其固定在底座贴片上，自然晾干后，用原子力显微镜（Atomic force microscope，AFM） 的OMCL-AC160TS 标准硅探针对样品进行扫描，设置扫描频率为1 Hz。

1.3.3.4 纤维素纳米晶体电势的测定 用马尔文纳米激光粒径仪测定样品的电势。用去离子水将样品稀释至0.05%（质量分数），以避免多次散射效应。每个样品平行测量3 次，电势以“±s”表示。

1.3.3.5 傅里叶红外变换光谱 利用傅里叶红外变换光谱测定不同处理纤维素样品中的化学键组成。用KBr 压片法制备样品。分别取2 mg 不同纤维素样品于研钵中，顺时针研磨至样品细致无结块，然后向样品中添加200 mg KBr，混合均匀。用红外压片机压成厚度为0.5 mm 的薄片，将压力维持在60 kN 2 min。用傅里叶红外变换光谱（Fourier transform infrared spectrum，FT-IR）对样品薄片进行红外扫描，通过观察图谱分析氧化纤维素与原料纤维素之间的化学键组成差异，分析样品的氧化水平。

1.3.3.6 X 射线衍射分析 利用X 射线衍射（Xray diffraction，XRD）判断不同处理纤维素样品中晶体的含量及纯度。X 射线衍射仪测量参数为Cu-Ke 的射线，扫描2 周，扫描速率为0.2 ℃/min，温度范围5～60 ℃。测量过程在40 kV 和25 mA 条件下完成。用XRD 仪比较氧化纤维素及原料纤维素的衍射图谱，分析不同样品间的晶体构成差异。

1.3.3.7 纤维素纳米颗粒接触角的测定 用压片法测定样品接触角，判断氧化纤维素的亲疏水性。分别称取2 mg 纤维素原料、氧化纤维素纳米球及纳米棒固体粉末，用红外压片机按1.3.3.5 节方法制成薄片。在玻璃皿内加入大豆油，将上述薄片浸入大豆油后固定，用注射器将水滴滴在压片上，用接触角测量仪采集图像。随后利用五点拟合法测定不同纤维素样品油-水界面的接触角θ。

1.3.4 Pickering 乳液的制备及观察 将15 mg 氧化纤维素纳米球和纳米棒粉末通过涡旋振荡分散于15 mL 去离子水中。冰浴条件下，用超声破碎仪将颗粒破碎为纳米级。添加0.05 mol/L NaCl 到水相并充分混匀，加入1.5 mL 大豆油，混匀后超声90 s，功率为160 W，交替开关周期为开4 s 关3 s。超声结束后得到稳定的Pickering 乳液。在大豆油中加入尼罗红染料可制得用荧光显微镜观察的样品。为了进一步利用超低温冷冻电镜（Cryo-SEM）观察Pickering 乳液的形态，必须迅速冷冻乳液，之后在超低温的真空环境中切开断面，观察乳滴的表面形态。用带正电荷的罗丹明B 静电吸附负电荷的氧化纤维素来荧光标记氧化纤维素，通过激光共聚焦显微镜可观察氧化纤维素在乳液液滴的分布情况。分别吸取10 μL 吸附罗丹明B 的氧化纤维素纳米球和纳米棒滴于载玻片上，在激发光波长570 nm、发射光波长590 nm 的条件下观察样品。

1.3.5 Pickering 乳液稳定性的测定 用Turbiscan 稳定分析仪测定乳液稳定性。通过测定激光得到样品散射强度，得到时间函数，分析各Pickering乳液在乳化过程中的动态变化。通过测量透射光和反向散射的变化强度，间接反映乳液的体积分数和平均直径，从而得到稳定性指数（Turbiscan stability index，TSI）。将不同原料制备的Pickering乳液样品放入样品管中，25 ℃下监测24 h。

1.3.6 体外模拟pH-Stat 滴定法测量游离脂肪酸的释放消化 体外模拟测定游离脂肪酸的方法参考Mat 等[19]的试验方法完成。Pickering 乳液的体外脂肪消化率主要通过自动电位滴定仪测定。在脂质消化过程中，用0.1 mol/L NaOH 溶液进行中和滴定，使溶液pH 值保持在7.0，中和脂肪消化产生的游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA）。消化池中反应体系的配制方法：将5 mL 胆汁盐溶液、1 mL 60 mg/mL 的CaCl2溶液及1.5 mL 脂肪酶溶液加入30 mL Pickering 乳液中。消化结束后，比较不同乳液NaOH 的消耗速率及体积，测定体外消化过程中释放的FFA。将不添加稳定剂的油水混合物和胆盐稳定乳液作为试验对照组。

FFA 的释放曲线通过公式 （1） 计算，通过GraphPad Prism 6 与双曲线公式（2）拟合；

式中，VNaOH——中和消化产生的FFA 所需的NaOH 体积 （mL）；CNaOH——中和反应完成所用NaOH 溶液的浓度（mol/L）；wLipid——消化池中最初存在的油的总质量 （g）；MLipid——油的分子质量（880 g/mol）。

式中，Rmax和Km是拟合参数：Rmax——最大降解速率；Km——反应速度（min）。

2 结果与分析

2.1 氧化纤维素纳米颗粒的形态表征

如图1a 所示，纤维素原料结构较为致密，排列整齐。经NaOH 溶胀处理的纤维素原料在TEMPO 氧化发生后，其纤维素葡萄糖上C6 位上羟基被氧化成羧基，形成亲水性提高的改性纤维素，在此基础上用超声破碎仪破碎材料，得到氧化纤维素纳米球。若纤维素原料不进行溶胀处理，而是直接进行TEMPO 氧化反应并超声处理，得到氧化纤维素纳米棒。氧化纤维素纳米球及纳米棒的TEM、SEM 及AFM 形貌图像如图2所示。在TEMPO 发生过程中，NaClO 将纤维素的羟基氧化为羧基，NaOH 的处理程度也会影响羟基的氧化效率。Zeta-电势结果显示（图1b），未经NaOH 溶胀的纤维素（-26.8 mV）经TEMPO 氧化和超声破碎后氧化纤维素纳米棒电势降低 （-43.1 mV），说明羟基成功氧化形成羧基，而用NaOH 溶胀的纤维素经TEMPO 氧化和超声破碎处理形成氧化纤维素纳米球，其电势降至-50.4 mV。由此可见，TEMPO 氧化使纤维素中羧基含量升高，负电荷增多，电势降低。氧化纤维素在水溶液中的分散性得到显著提高（图1c），这是由于氧化产生的负电荷和减小的粒径增强了氧化纤维素的水溶液分散性。

图1 纤维素原料扫描电镜照片及氧化纤维素纳米颗粒的电势和水溶液照片Fig.1 Morphological pictures of cellulose raw materials，zeta-potential and aqueous solution of oxidized cellulose nanoparticles

图2 氧化纤维素纳米颗粒的扫描电子显微镜、透射电子显微镜、原子力显微镜形貌图像Fig.2 Morphological pictures of scan electron microscope，transmission electron microscope，and atomic force microscope of oxidized cellulose nanoparticles

2.2 氧化纤维素纳米颗粒的化学和物理结构表征

由FT-IR 分析纤维素原料及两种氧化纤维素纳米颗粒的化学键组成。如图3a 所示，与纤维素原料相比，氧化纤维素纳米棒及纳米球的FT-IR图谱显示碳氧双键吸收峰（1 600 cm-1），以及羧基的碳氧单键吸收峰（1 390 cm-1），这表明TEMPO氧化使得纤维素羟基转化为羧基，且羧基亲水性较强，因此TEMPO 氧化后显著提高了纤维素原料的亲水性，同时改变了纤维素的界面活性。

通过X 射线衍射图谱可以判断晶体结晶度、结晶含量及纯度。如图3b 所示，2θ 为22.5°处出现纤维素原料结晶的特征衍射峰，而改性得到的氧化纤维素纳米球和纳米棒特征衍射峰显著减弱。由此可见TEMPO 氧化过程在一定程度上破坏了纤维素材料的结晶区。羟基氧化得到的羧基带负电荷，这可以削弱分子间的氢键作用，打开纤维素链之间的联接，从而形成球状结构。

图3 氧化纤维素纳米颗粒红外光谱图像和X 射线衍射图谱Fig.3 Fourier transform infrared spectrum image and X-ray diffraction pattern of oxidized cellulose nanoparticles

2.3 氧化纤维素纳米颗粒的接触角表征

纤维素在油水界面的接触角为θ，该值可直观表征被测材料的亲、疏水性。若θ 小于90°，则该物质具有亲水性，且θ 越小，亲水性越强；若θ 大于90°，则该物质的疏水性强。如表1所示，氧化前纤维素的θ 为130.5°，材料具有疏水性。而氧化后纤维素的θ 小于90°，这是由于氧化过程中羧基含量增加使材料亲水性显著增强，且氧化纤维素纳米球的θ（55.5°）与氧化纤维素纳米棒的θ（65.1°）相比较小，这是由于NaOH 溶胀处理使TEMPO 氧化的发生效率高，因此氧化纤维素纳米球的羧基含量高，即亲水性强。固体颗粒在乳液界面的稳定性是由多重因素共同影响，为进一步了解材料的表面性质，需分析氧化纤维素纳米颗粒的表面张力。

表1 氧化前、后纤维素的接触角比较Table 1 Comparison of contact angle of oxidized cellulose and cellulose raw material

固体颗粒在油-水界面的吸附会使表面张力值下降，表面张力的平衡值随界面吸附颗粒的增加而降低。如图4b 所示，纤维素原料质量浓度为1 mg/mL 时，其表面张力随测定时间延长先迅速下降，而后达到17.9 mN/m 的平衡值。材料氧化度升高，亲水性增加，其表面张力相应降低，即制备的氧化纤维素纳米球及纳米棒的平衡表面张力均有所降低（氧化纤维素纳米球：15.4 mN/m；氧化纤维素纳米棒：16.4 mN/m）。

图4 氧化纤维素的接触角示意图（a）及表面张力动态平衡图（b）Fig.4 Contact angle figure （a） and dynamic equilibrium diagram （b） of surface tension of oxidized cellulose

2.4 纤维素浓度对Pickering 乳液稳定性的影响

形成Pickering 乳液时，固体颗粒的尺寸是影响乳液稳定性的重要因素，这是由于乳化能量壁垒和固体颗粒半径的平方成正比，因此固体颗粒尺寸越小，形成乳液所需克服的能量壁垒越小。经氧化改性纤维素的尺寸从微米级降到纳米级，乳化能量壁垒缩小近100 万倍，有效增强了乳液的稳定性[20-21]。

探究不同浓度纤维素纳米颗粒对Pickering乳液稳定性的影响。如图5所示，增加氧化纤维素纳米球或纳米棒的浓度，Pickering 乳液的稳定性均得到提高，而当纳米球或纳米棒的质量浓度提高到3 mg/mL 时，两种乳液出现浮沫，乳液中出现油滴析出、油滴变大的现象。当纤维素含量过高时，界面上分布的纤维素含量增加，导致排斥絮凝（Depletion interaction）发生。最终选择1 mg/mL 氧化纤维素纳米颗粒制备Pickering 乳液，在此质量浓度下纤维素比较均匀且充分地排布在界面上形成相对稳定的界面膜，溶液中散布的氧化纤维素较少，不会导致排斥絮凝。

图5 不同浓度纤维素纳米晶体对Pickering 乳液稳定性的影响Fig.5 Effect of various concentration of cellulose nanocrystal on the stability of emulsion

2.5 氧化纤维素Pickering 乳液的界面特性

采用罗丹明B 荧光标记氧化纤维素纳米颗粒，通过激光共聚焦显微镜观察乳液中氧化纤维素的分布情况（图6a），结果可清楚观察到红色荧光的氧化纤维素被吸附在油滴周围以稳定Pickering 乳液。在某些区域氧化纤维素纳米颗粒Pickering 乳液出现聚集现象，这可能是因为在观察期间乳液间产生并聚现象。

用液氮将氧化纤维素纳米颗粒稳定的Pickering 乳液直接冷冻后，用低温恒温器切割样品，通过Cryo-SEM 观察样品横截面，结果如图6b 所示。当温度降至-80 ℃时，水分子通过升华去除，乳液中的油相以球状存在，球状周围存在的颗粒即氧化纤维素纳米颗粒。如图6b 所示，氧化纤维素纳米球在乳液界面上紧密排布，且覆盖率高；纳米棒虽将油滴包裹起来，但仍有长纤维。这些结果表明氧化纤维素可吸附在油滴表面，与图6a 结果一致，氧化纤维素纳米球和纳米棒均能吸附在油水界面以稳定Pickering 乳液。

图6 Pickering 乳液的界面特性Fig.6 Interface property of Pickering emulsion

2.6 不同纤维素颗粒Pickering 乳液的稳定性比较

Turbiscan 静态稳定性分析仪能在不破坏样品初始状态的情况下判断乳液是否发生沉淀、分相、絮凝的现象，其依据散射光强度与分散相浓度及粒子平均直径的定量关系，Turbiscan 稳定性指数TSI 越大体系越不稳定。图7a 表明不同纳米颗粒制备的乳液在24 h 内稳定状态的变化。油水混合物及添加纤维素原料制备的乳液，其稳定性指数TSI 在短时间内迅速增大。而由氧化纤维素纳米颗粒制得的乳液稳定性有很大提升，24 h 内稳定性指数仅小幅度提升，且由氧化纤维素纳米棒稳定的乳液具有更高的稳定性，这可能是因为纤维状结构更易在油滴表面形成界面网络结构，形成机械强度较高的界面膜，从而使乳液具有更高的稳定性[22-23]。

图7 Pickering 水包油乳液稳定性指数TSI 变化（a）及界面稳定示意图 （b）Fig.7 Turbiscan stability index （a） and interface stability diagram of Pickering oil-in-water emulsion （b）

2.7 不同形貌氧化纤维素稳定的Pickering 乳液对脂肪消化的影响

为了明确不同形貌的氧化纤维素稳定的水包油型Pickering 乳液是否能延缓内油相中甘油三酯的消化，通过NaOH 滴定法测定甘油三酯水解时产生的脂肪酸含量，探究不同纤维素纳米颗粒稳定的水包油乳液在模拟肠液中2 h 内所消化产生的脂肪酸（FFA）的释放动力学，并与油水混合物、胆酸盐和氧化纤维素稳定乳液等不同组之间的油脂消化能力相比较。油水混合物和胆盐稳定的乳液呈现出较快速的脂肪消化，而纤维素Pickering 乳液明显延缓了脂肪的消化（图8a，8b）。如图8c 所示，油水混合物的最大降解率Rmax在肠液消化结束后可达到90%，胆盐稳定乳液的脂肪酸释放率与油水混合物相比有所降低，达70%。经肠液消化后，未改性纤维素乳液的Rmax达32%，可以看到纤维素本身就具有降低油脂消化的特性。值得注意的是，氧化纤维素纳米球及纳米棒能更加显著地降低油脂的消化（P＜0.001），纳米球乳液最终的Rmax可达9.2%，而纳米棒仅为4.5%（图8c）。图8d 表明纤维素乳液具有比油水混合、胆盐乳液更低的反应速率Km，这是因为纤维素对脂肪酶产生较强的空间位阻作用，因而降低了其消化速率。Bai 等[24]研究证明纤维素通过置换胆盐及限制脂肪酶吸附来维持Pickering 乳液稳定。脂肪酶发挥作用需吸附在油滴表面，而纤维素在油水界面上形成的固体颗粒界面膜可阻止脂肪酶在油滴上的附着。纤维素纳米棒更易形成网络结构，其对脂肪酶的阻滞效果强于纤维素纳米球颗粒。

图8 不同颗粒Pickering 乳液的脂肪消化能力比较Fig.8 Comparison of fat digestibility of different particle Pickering emulsions

3 结论

采用TEMPO 氧化法对农业废弃生物质玉米芯中提取的纤维素进行羧基化改性，将其碳六位伯醇基氧化为羧基，并采用不同的处理方法制得氧化纤维素纳米球及纳米棒。氧化纤维素纳米球和纳米棒的尺寸比纤维素原料的尺寸降低了1 000 倍，使得乳液的乳化能量壁垒降低了100 万倍。此外，氧化度提高，使改性后纤维素的亲水性得到改善，这为提高Pickering 乳液的稳定性提供了结构基础。在纳米颗粒质量浓度为1 mg/mL，乳液体系pH 7，CaCl2浓度为0.05 mol/L 的条件下，较纤维素原料而言，氧化纤维素纳米球和纳米棒均能有效提高Pickering 乳液稳定性。体外脂肪消化研究表明，氧化纤维素纳米球及纳米棒均可在油水界面上形成致密固体颗粒膜阻止脂肪酶分解油脂，推测氧化纤维素纳米棒更易形成网络结构，防止脂肪消化的能力更强。该研究成果表明纤维素Pickering 乳液在开发低热量食品中具有广阔的应用前景，且为农业废弃生物质玉米芯的高值化利用提供了理论基础。