重组布鲁菌外膜蛋白Omp19 的制备方法及免疫原性研究

辜彦霏，殷 瑛，李玉杰，宰晓东，徐俊杰

（军事科学院军事医学研究院生物工程研究所，北京 100071）

布鲁菌病（brucellosis）简称布病，是由布鲁菌（Brucella）感染引起的一种人畜共患病。 我国将该病列为乙类传染病。 布病严重影响人类健康和畜牧业生产安全， 人主要通过接触感染病畜及其产品、污染物，或食用消毒不彻底的动物源性食品而患病。 患者通常表现为波浪热、脊柱炎、关节炎等非特异性症状，并伴随神经、生殖、免疫系统损伤［1-2］。 目前世界范围内有170 多个国家和地区存在人、 畜布病的流行， 人间布病新发病例数约为50 万人次/年［3-4］。 我国是人间布病的历史疫区，2000 年以后布病感染范围从北方牧区迅速扩展至沿海及东南部，且呈持续上升趋势［5］。

疫苗接种是预防布病最经济、有效的手段［6］。目前在研的布病疫苗类型主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、核酸疫苗、载体疫苗等［7］。 兽用布病疫苗已经获批用于动物疫情的防控，包括牛种S19/A19、RB51，羊种Rev.1、M5，猪种S2 等，主要为减毒活疫苗［8］。 人用布病疫苗仅在我国和俄罗斯获批。 牛种减毒活疫苗104M 是我国唯一获批的人用布病疫苗， 但是由于接种方式复杂（皮上划痕）、接种剂量不可控、安全性有待提高等问题，不适宜大规模接种［9］。 重组亚单位疫苗成分简单、安全性高、易于质控，是目前新型布病疫苗研发的重要方向［10］。

外膜蛋白Omp19（outer membrane protein 19）存在于布鲁菌表面，对细菌的黏附、侵袭、定植以及胞内存活等多项功能起着关键作用。 Omp19 蛋白在布鲁菌不同种型中同源性达到90%以上，可诱导小鼠Th1 和Th2 免疫反应， 并对Brucella melitensis （B.melitensis）16 M 和B.abortus 544 等布鲁菌强毒株具有较好的攻毒保护效力， 被认为是重组布病疫苗的重要候选组分［11-12］。 笔者所在实验室前期已构建可稳定表达重组Omp19 蛋白的大肠杆菌工程株，并初步探索了制备方法［13］。该研究对重组布鲁菌Omp19 蛋白的制备方法进行优化，从培养基类型、诱导剂（IPTG）浓度、诱导时间、诱导时的菌体密度、诱导温度等影响重组蛋白表达的关键参数入手，确定最佳的摇瓶培养条件；采用阳离子交换、 疏水层析和阴离子交换的组合方法，优化重组Omp19 蛋白的纯化方法，对制备的目的蛋白进行纯度测定， 并对其在小鼠体内的免疫原性进行评价，以期为研发基于Omp19 蛋白的重组布病亚单位疫苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物与工程菌株

6～8 周龄雌性BALB/c 小鼠24 只， 购自斯贝福（北京）生物技术有限公司；可稳定表达重组布鲁菌Omp19 蛋白的大肠杆菌工程株（以下称Omp19工程菌株），保存于军事科学院军事医学研究院生物工程研究所疫苗与抗体工程研究室。

1.1.2 试剂与耗材

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp），购自北京全式金生物技术股份有限公司；SOB、LB 培养基，购自OXOID 公司；SOC、2×YT 培养基、TMB 显色液、ELISA 终止液，索莱宝科技有限公司产品；醋酸钠（NaAC）、氯化钠（NaCl）、Tris，购自国药集团化学试剂有限公司；PBS，购自Gibco 公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a，购自Abcam 公司；SP SepharoseTMXL （SPXL） 柱、Phenyl SepharoseTMHigh Performance （Hp） 柱、DEAE SepharoseTMFast Flow（DEAE）柱，购自GE Healthcare 公司。

1.1.3 仪器与设备

立式离心机（型号：Avanti J25I），购自BECKMAN COULTER 公司； 台式离心机 （型号：Centrifuge 5424）、摇床（型号：innova 43），购自Eppendorf 公 司； 分 光 光 度 计 （型 号：Libra）， 购 自Biochrom 公司；制冰机（型号：SIM-F140AY65），购自SANYO 公 司；SDS-PAGE 电 泳 仪 （型 号：1658001）， 购自Bio-Rad 公司； 纯化仪 （型号：ÄKTA Pure），购自GE Healthcare 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养条?件优化

1.2.1.1 培养基

将Omp19 工程菌株划线接种于LB 平板，37 ℃培养12～16 h，挑取单克隆至100 mL LB 培养基（含100 μg/mL Amp），37 ℃、220 r/min 振荡过夜培养15 h。 将上述培养物按1∶100 的比例分别接种至1 L 的SOB、SOC、2×YT 和LB 培养基 （含Amp），37 ℃振荡培养至OD600nm值达到0.6～0.8，加入终浓度为1 mmol/L 的IPTG，28 ℃振荡培养5 h。取1 mL 培养物12 000 r/min 离心5 min，收集菌体沉淀，重悬后加入6×SDS 上样缓冲液，99 ℃加热5 min。 离心后取上清液，用15%SDS-PAGE 分析目的蛋白的表达。 以未加IPTG 诱导的菌体作为对照。利用BandScan 软件对SDS-PAGE 胶中检测到的目的蛋白表达百分含量进行灰度扫描。

1.2.1.2 诱导剂浓度

挑取单克隆过夜培养， 次日转接至4 个1 L LB 培养基中，操作同“1.2.1.1”项下。 37 ℃振荡培养至OD600nm值达到0.6～0.8，向4 个培养瓶中加入IPTG， 使 其 终 浓 度 分 别 为0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L，28 ℃振荡培养5 h。 制样及分析方法同“1.2.1.1”项下。

1.2.1.3 诱导温度

挑取单克隆过夜培养， 次日转接至2 个1 L LB 培养基中，操作同“1.2.1.1”项下。 37 ℃振荡培养至OD600nm值达到0.6～0.8， 加入终浓度为1 mmol/L 的IPTG，分别于28、37 ℃振荡培养5 h。 制样及分析方法同“1.2.1.1”项下。

1.2.1.4 诱导时间

挑取单克隆过夜培养， 次日转接至4 个1 L LB 培养基中，操作同“1.2.1.1”项下。 37 ℃振荡培养至OD600nm值达到0.6～0.8， 加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，于28 ℃分别振荡培养2、3、4、5 h。制样及分析方法同“1.2.1.1”项下。

1.2.1.5 诱导时菌体密度

1.2.2 表达产物纯化

收集的菌体按照W∶V 为1∶10 的比例加入20 mmol/L NaAc、1 mmol/L NaCl 重悬菌体， 于冰水浴中进行超声破菌。4 ℃、8 500 r/min 离心20 min，上清液经0.45 μm 滤器过滤后作为纯化样品。 使用SPXL 阳离子柱，用20 mmol/L NaAc、1 mmol/L Na-Cl 溶液对样品进行粗纯。 获得收集液后使用苯基柱（Hp）和20 mmol/L Tris 缓冲液对目的蛋白进行第2 步纯化。为进一步提高蛋白纯度，降低内毒素含量， 利用DEAE 柱和PBS 缓冲液对收集液进行第3 步纯化。 收集纯化后的样品用15%的SDSPAGE 进行检测。

1.2.3 表达产物纯度测定

收集纯化后的蛋白样品， 委托青莲百奥公司利用分子排阻高效液相色谱法（SEC-HPLC）对蛋白纯度进行测定。 方法简述如下： 利用Agilent 1260 infinityⅡ进行纯度检测， 色谱柱为Thermo MAbPac SEC-1，流动相为10 mmol/L PBS，流速为0.2 mL/min，上样体积为10 μL，洗脱时间为15 min。首先进行系统平衡， 压力和基线稳定后加载样本进行纯度分析。

1.2.4 动物实验

将24 只6～8 周龄的BALB/c 雌性小鼠随机分成3 组， 饲养于军事科学院军事医学研究院动物中心SPF 级动物房。 分别腿部肌肉注射重组Omp19 蛋白（n=8）、重组Omp19 蛋白联合Al（OH）3佐剂（简称Al 佐剂）及CpG 佐剂（n=8）、PBS 溶液（n=8，阴性对照组）。Omp19 蛋白用量为5 μg/（只·次），Al、CpG 佐剂用量分别为50、25 μg/（只·次）。各组于0 d 初免，14 d 进行加强免疫。

1.2.5 免疫原性测定

道路路面施工的质量控制，必须对其摊铺施工温度做好实时把控，在公路施工前对相应沥青混凝土做加热至施工要求设置，使混凝土活性充分得以体现。注重其温度过低，便会影响沥青压实度和黏结度，引发沥青液情况出现；而温度过高便会引发施工设备部件溶解，严重损害设备质量。

初免后28 d 采血，分离血清，使用ELISA 法检测抗重组Omp19 蛋白特异性抗体。 将Omp19蛋白用包被液稀释至2 μg/mL，加入96 孔板，每孔100 μL，4 ℃过夜包被； 次日用PBST （PBS，2%吐温-20）洗板后加入封闭液（PBS，2%BSA），37 ℃封闭1 h；洗板后将待测血清梯度稀释，阴性对照为按照1∶200 稀释的免疫前血清。 37 ℃孵育1 h；洗板，按1∶10 000 的比例加入HRP 标记的羊抗鼠抗体IgG、IgG1、IgG2a，37 ℃孵育45 min；洗板，加入TMB 显色液避光6 min；加入终止液。 用Bio-Rad酶标仪检测OD450nm值和OD630nm值，以OD=OD450nm-OD630nm作为最终吸光度值，大于2.1 倍阴性对照孔OD 值的最大稀释度判定为该血清样品的滴度。

1.2.6 统计学分析

采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA）进行显著性检验， 制图与数据分析均由Graphpad Prism 9.0 软件完成。P＜0.05 认为具有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 重组Omp19 蛋白培养条件优化

2.1.1 培养基

分别使用4 种培养基对Omp19 工程菌株进行诱导培养。 该研究中重组布鲁菌Omp19 蛋白理论分子量约为16 kDa。 SDS-PAGE 分析结果显示（见图1）， 在4 种培养产物的泳道中接近25 kDa处均可检测到明显的蛋白表达条带， 与前期经Western blotting 鉴定的蛋白条带位置一致， 可判定为目的蛋白。 使用BandScan 软件对SDS-PAGE泳道中目的蛋白的含量进行灰度扫描，结果表明，使用SOB、SOC、2×YT、LB 培养基诱导表达Omp19蛋白的百分含量分别为34.4%、39.5%、42.3%、38.2%。 这提示4 种培养基对Omp19 蛋白的表达影响不大，考虑到应用成本选用LB 培养基开展后续研究。

2.1.2 诱导剂浓度

在不同IPTG 浓度下对目的蛋白进行诱导表达。SDS-PAGE 分析结果显示（见图2），IPTG 浓度为0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L 时，重组Omp19 蛋白均能有效表达。 灰度扫描结果表明，2～5 泳道中目的蛋白的百分含量分别为26.8%、28.1%、25.7%、27.1%。提示在IPTG 使用量达到0.5 mmol/L后继续增加IPTG 的浓度， 并未明显增加Omp19蛋白的表达量。

2.1.3 诱导温度

考查常用诱导温度28、37 ℃对目的蛋白表达量的影响，结果显示（见图3），28、37 ℃均可诱导重组Omp19 蛋白的表达，且2 个诱导温度下目的蛋白表达量相差不大 （灰度扫描结果均为19.1%）。由于低温下蛋白合成速度减慢，更有利于正确折叠，所以，确定28 ℃作为诱导温度。

2.1.4 诱导时间

比较不同诱导时间对重组Omp19 蛋白表达量的影响。 于28 ℃分别诱导培养2、3、4、5 h，收集菌体对目的蛋白的表达量进行检测。如图4 所示，目的蛋白表达量随诱导时间增加逐渐升高。 灰度扫描结果表明，2～5 泳道中目的蛋白的百分含量分别为23.4%、31.2%、35.1%、38.6%。 这提示在给定的诱导时间内，诱导5 h 目的蛋白表达量最高。

2.1.5 诱导时菌体密度

比较诱导时的不同菌体密度对重组Omp19蛋白表达量的影响。 SDS-PAGE 分析（见图5）和灰度扫描结果显示，在菌体密度OD600nm值为0.4、0.6、0.8、1.0 时分别对目的蛋白进行诱导表达，重组Omp19 蛋白的表达量分别为21.2%、34.1%、27.9%、27.3%。 这提示菌体密度OD600nm值为0.6～1.0 时，目的蛋白表达百分含量相对较高。

2.2 重组Omp19 蛋白纯化工艺探索

利用GE 公司的ÄKTA 纯化设备， 组合使用阳离子层析、 疏水层析和阴离子层析的方法对目的蛋白纯化并进行电泳检测。如图6 所示，与预期结果一致，1～5 泳道显示出清晰且单一的条带，提示获得了纯度较高的重组Omp19 蛋白。

2.3 重组Omp19 蛋白纯度测定

使用SEC-HPLC 法对纯化后的重组Omp19蛋白进行纯度分析。如图7 所示，蛋白主峰的保留时间为6.803 min，峰高为100.9 mAU，峰面积百分比为100%，提示经3 步纯化后获得的重组Omp19蛋白具有较高的纯度。

2.4 重组Omp19 蛋白免疫原性分析

使用重组Omp19 蛋白联合佐剂免疫小鼠后，通过ELISA 检测针对Omp19 蛋白的特异性总抗体及抗体亚类水平。 如图8 所示，初免后28 d（二免后14 d）Omp19+Al+CpG 免疫组激发的特异性IgG 总抗体滴度约为1.6×105，显著（P＜0.000 1）高于Omp19 单独免疫组和PBS 免疫组。抗体亚类检测结果与总IgG 类似，Omp19+Al+CpG 免疫组可以显著（P＜0.000 1）诱导IgG1 和IgG2a 的产生。 这提示经方法优化后制备的重组Omp19 蛋白联合Al（OH）3和CpG 佐剂可以有效刺激小鼠产生特异性抗体。

3 讨论

布鲁菌是一种细胞内寄生的革兰阴性菌，可以通过抑制吞噬体—溶酶体融合逃避杀菌机制，干扰细胞内运输， 使细菌在宿主细胞内存活、复制，形成慢性感染。接种安全有效的疫苗是防控布鲁菌感染的重要手段。 重组蛋白疫苗由于安全性高、质量可控，是目前新型布病疫苗研发的重要方向之一。前期为研发布病重组蛋白疫苗，笔者所在研究团队通过串联质谱方法对人用布病疫苗株104M 进行了蛋白质基因组学研究以及保护性抗原预测，筛选到Omp19 是一种较有潜力的候选抗原，并初步验证了免疫原性和保护效果［13-14］。 多项研究均报道外膜蛋白Omp19 可能是重组布病疫苗 的 重 要 靶 标［10，15］。 此 外，Coria 等［16］还 报 道Omp19 蛋白具有针对胃肠道和溶酶体蛋白酶的抑制剂活性， 能帮助布鲁菌逃避宿主蛋白酶水解防御系统的抗菌活性。 Omp19 的蛋白酶抑制剂功能使其有望作为一种新型佐剂， 辅助口服疫苗的开发。 建立并优化重组Omp19 蛋白的制备方法对于研发基于Omp19 蛋白的重组布病疫苗具有重要意义。

该研究基于摇瓶试验对重组布鲁菌Omp19蛋白的原核表达条件进行了优化，确定了Omp19蛋白较优的诱导条件为：使用LB 培养基，在OD600nm值为0.6～1.0 时加入0.5 mmol/L 的IPTG 诱导剂，于28 ℃诱导5 h。于该条件下使用阳离子柱、疏水柱和阴离子柱相结合的3 步纯化工艺得到了重组Omp19 蛋白，并利用SDS-PAGE 和SEC-HPLC 方法对重组蛋白的纯度进行了测定。 免疫原性研究结果表明，经方法优化后制备的Omp19 蛋白联合佐剂可以较好地刺激小鼠特异性抗体的产生。

4 结论

该研究优化了重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法，明晰了其在小鼠中的免疫原性，为重组布鲁菌疫苗的研发提供了基础。