中医“实热”上火牙龈炎患者血清蛋白质组学特征研究*

张 苗 贺源方 谢冠群 徐 莉 范永升 陈 娟

浙江中医药大学基础医学院 浙江 杭州 310053

上火是中医学的专有名词，是由“火热之邪”侵袭人体造成的火热病症，临床以口腔溃疡、牙龈炎、鼻衄、咽痛口干、失眠症、口臭、便秘等为典型症状[1]。根据“上火”虚实病机的不同，分为“实热”上火和“虚热”上火，前者属“热证”范畴，因体内阴阳消长失衡，同时邪热亢盛、内外俱实所致[2]。牙龈炎患者常见胃火上炎，牙龈肿痛、出血，伴见口臭等症。本研究采用相对和绝对定量同位素标记法，结合生物信息学用于牙龈炎及其常见“实热”证的血清蛋白代谢特征研究，探讨其科学内涵，结合中医学注重整体观念的理论优势，不仅能丰富科学内涵，而且对于防治“实热”上火和改善人们的生活质量具有现实意义。

1 资料采集

1.1 样本来源：选取2016年2～6月就诊于浙江中医药大学附属第一医院中医内科、口腔科、体检中心的“实热”上火牙龈炎患者16例和对照组健康人群17例。牙龈炎组（观察组）年龄20～43(26.38±6.85)岁，其中男性8例，女性8例。对照组年龄21～39(28.06±5.53)岁，其中男性7例，女性10例。两组人群年龄及性别均无显著性差异(P＞0.05)。

1.2 西医诊断标准[3]：①以牙龈出血或龈齿间溢脓，牙齿松动，影响咬嚼为主要症状。②缓慢起病，逐渐加重，严重者发展为全口牙齿松动。病程中可有急性发作的牙周脓肿，局部红肿热痛，脓液量多，伴有发热。③口腔检查：牙龈红肿或萎缩，易出血，牙根宣露，牙齿松动。牙齿上附着牙垢、牙石。龈齿间有逐渐扩大的牙周袋，袋内溢脓。有口臭。④牙根周围X线片示：牙槽嵴吸收、牙间隙增宽等表现。

1.3 中医辨证标准：依据1994年发布的中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》中牙宣（牙龈炎）诊断标准：实热型（胃火炽盛）：牙龈作痛、出血，口气热臭，渴喜冷饮，大便干结。牙龈红肿疼痛，溢出脓血。舌红、苔黄，脉数。

1.4 健康人群入选标准：①健康的正常人，无“上火”症状，符合平和质的诊断标准。舌质淡红、苔薄白，脉缓和；②年龄在20～50周岁；③自愿参加本实验并签署进入临床研究知情同意书者。

1.5 “实热”上火牙龈炎患者纳入标准：符合“实热”上火牙龈炎患者诊断标准；自愿参加本实验并签署进入临床研究知情同意书者；年龄在20～50周岁。

1.6 排除标准：不符合入选标准者；合并各系统靶器官严重病变、精神病、肿瘤等疾病的患者；妊娠及哺乳期的妇女；研究中认为有任何不适宜入选的情况。

2 方法

2.1 样本采集：所有受试者入组后，采集清晨空腹血样10ml，分装于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝试管内，立即混匀。2000r/min，l0min分离血浆后，转移上层血浆至1.5ml离心管中。分装后于-40℃冰箱保存待检。

2.2 试剂与仪器：相对与绝对定量同位素标记（iTRAQ）试剂盒(Applied Biosys-tems，Foster city，CA，USA)，胰蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO，USA),Labconco CentriVap冷冻离心浓缩仪(Labconco，USA)，Agilent MARS-14柱(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)，Pierce™白蛋白/IgG去除试剂盒。

2.3 iTRAQ标记：根据iTRAQ试剂盒说明书对各组血清样品进行iTRAQ标记。使用Agilent MARS-14柱去除包括白蛋白、IgG和触珠蛋白等在内的14种高丰度蛋白，得到更多的低丰度蛋白富集，然后蛋白质被浓缩和脱盐，通过Bradford方法定量蛋白质样品的洗脱液。接着将蛋白质样品还原，烷基化，最后用胰蛋白酶在37℃下消化过夜。

2.4 数据处理和统计分析：通过Gene Ontology(GO)数据库分析差异表达蛋白质，包括细胞组分、分子功能和生物学过程。蛋白质的相互作用网络通过STRING（http：//stringdb.org/）进行分析。利用基因组学途径数据库KEGG(http：//www.genome.jp/kegg/mapper.html)进行路径分析。采用SPSS 25.0统计软件对数据进行统计学分析，计量数据用均值±标准差(±s)表示，均值间差异比较用独立样本t检验；计数资料用χ2检验，均采用双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 血清差异蛋白定量分析：基于iTRAQ标记结合LCMS/MS技术筛选对照组与“实热”上火组差异蛋白，实验重复两次并将两次鉴定结果合并，选取overlap部分，通过对方差分析(Aov分析)，卡值后的差异蛋白数量进行统计，筛选到观察组与对照组间43个差异表达蛋白(P＜0.05)，其中上调蛋白27个(倍率＞1.25,见表1)，下调蛋白16个(倍率＜0.8,见表2)。

表1 “实热”上火牙龈炎人群血浆上调的差异蛋白质

表2 “实热”上火牙龈炎人群血浆下调的差异蛋白质

3.2 血浆差异蛋白生物信息学分析：GO富集分析显示对照组和“实热”上火牙龈炎组差异化蛋白主要参与血小板激活、急性炎症反应、体液免疫应答、血液凝固(图1A)。此外差异蛋白集中定位于血液微粒、血小板α颗粒、高密度脂蛋白粒子、血浆脂蛋白粒子(图1B)。功能富集分析表明绝大多数蛋白在信号转导、蛋白质降解、应激信号传导、炎症反应和凋亡中起着至关重要的作用(图1C)。KEGG通路分析(图2)后，根据富集的结果发现差异蛋白富集在细胞吞噬、凝血和补体级联、炎症感染等通路。通过STRING蛋白质网络图(图3)展现得到的蛋白质之间整个的网络图，网络图集中指向纤溶-凝血-补体系统，以及脂质代谢异常。

图1 “实热”上火牙龈炎差异蛋白GO功能富集分析

图2 “实热”上火牙龈炎血浆差异蛋白KEGG通路分析

图3 STRING软件分析的蛋白质网络作用图

4 讨论

“上火”的病因病机较为复杂，其形成与发展必然会引起脏腑功能失调以及机体物质代谢水平的紊乱。C反应蛋白(CRP)在肝脏中合成，是血浆中的主要蛋白质[4]。其参与免疫反应，是先天免疫反应的一部分。因此常常作为诊断感染的生物学指标。

载脂蛋白是一类家族较庞大的蛋白，能够结合和运输血脂到机体各组织进行代谢及利用。载脂蛋白(APO)D可以参与脂质运输、食物摄取、炎症、抗氧化反应，APOD与高密度脂蛋白的相关性最强，与低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白(LDL和VLDL)的相关性较低[5]。有研究表明APOD的神经保护和抗炎作用可能源于它将花生四烯酸(AA)稳定在细胞膜上或将其隔离，从而阻止其转化为促炎分子[6]。HDL被认为是抗动脉粥样硬化的物质，载脂蛋白C-II是高密度脂蛋白(HDL)的组成成分。载脂蛋白M具有抗动脉粥样硬化和抗炎特征，主要作用于HDL，其对于HDL的形成至关重要[7]。HDL可以通过刺激内皮细胞一氧化氮(NO)的产生，减少内皮活性氧(ROS)的产生，从而防止内皮的促炎反应。但有研究证明，它们的生物学特性可以通过血清淀粉样蛋白A(SAA)的积累而改变。添加了SAA的HDL减少了内皮细胞NO的产生，SAA可以将HDL转化为促炎颗粒，从而刺激血管内皮细胞的活化[8]。研究发现“实热”上火牙龈炎组C反应蛋白(CRP)、载脂蛋白D、载脂蛋白M、载脂蛋白C-II和血清淀粉样蛋白A(SAA)的上调，说明对照组的脂质代谢异常，抗炎能力下降，抗氧化能力降低，且与炎症反应密切相关。

KEGG通路分析发现差异蛋白富集在凝血与补体级联反应信号通路。此通路是内源性凝血激活途径和经典补体激活的重要途径。凝血因子XII(FXII)是一种蛋白酶，与带负电的表面接触后，FXII转换为两链活性形式FXIIa。FXIIa通过激活XI因子来启动内在的凝血途径。此外，FXIIa通过PK介导的尿激酶激活来启动纤维蛋白溶解，并激活经典补体途径[9]。补体的过度(异常)活化可以引起炎性反应及组织损伤[10]。因此，可以推断差异蛋白凝血因子XII、补体C1r、C1s升高，会进一步导致凝血功能下降，造成牙龈出血。

在下调的差异蛋白中，我们发现一种蛋白α-1抗胰蛋白酶。它是血液循环系统中最丰富的丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有保护细胞、阻止细胞凋亡的作用[11]。热休克蛋白可保护细胞内蛋白质免受热休克、毒性、缺氧和炎症的影响[12]。微管蛋白是微管(细胞骨架)的主要成分[13]。细胞骨架在维持细胞形态和组织稳定性以及细胞运动性、细胞增殖和细胞通讯中起着基本作用[14]。我们发现，微管蛋白β微管蛋链在“实热”上火牙龈炎组中被上调，推测牙龈炎与细胞骨架紊乱密切相关。

本研究发现“实热”上火牙龈炎的症状可能通过凝血-补体级联反应信号通路引起，信号通路上的差异蛋白可以作为“实热”上火牙龈炎基础研究的潜在靶点。另外一些急性相蛋白、载脂蛋白合并血清淀粉样蛋白A(SAA)的变化；α-1抗胰蛋白酶、热休克蛋白、微管蛋白β胰蛋白下调会引起抗氧化能力降低，诱发炎症反应，破坏细胞形态。本研究为牙龈炎的临床诊断和中西医治疗提供了参考，也为实热“上火”表征的另一路径或靶向治疗提供了科学依据。