微生物菌剂对小叶杨复垦区土壤理化性质和酶活性的影响

侯晓萌，孔 涛＊，霍宏亮，狄军贞，冯奥哲，程昊天，黄丽华

(1. 辽宁工程技术大学环境科学与工程学院，辽宁 阜新 123000；2. 中国农业科学院果树研究所，辽宁 葫芦岛 125100；3. 辽宁工程技术大学土木工程学院，辽宁 阜新 123000)

土地沙化、水土流失等土壤侵蚀问题是当今全球生态环境面临的严峻挑战，而我国已成为土壤侵蚀问题最为严重的国家之一。2020 年统计数据显示，受水力作用侵蚀的水土流失面积为112 万km2，受风力作用侵蚀的水土流失面积为157 万km2，风力和水力侵蚀问题依然严峻[1]。辽西北地区地域开阔，处于半干旱牧区和半湿润农业区之间的过渡区域[2]，在水力与风力双重侵蚀作用下，该区气候复杂多变、自然灾害频发、土质疏松且养分匮乏，加上人类不合理的利用，给土壤生态环境带来巨大的负面效应，其服务功能不断衰退，形成“生态脆弱带”[3-5]。

小叶杨（Populus simoniiCarr）为杨柳科，落叶乔木，是中国原产型深根性阔叶树种，其根系发达，适应性强，抗旱、抗寒、防风固沙，在风蚀水蚀交错区栽植较多，是土壤修复的优选树种。植被复垦技术可以有效修复土壤生态[6]，但风蚀水蚀交错区的土壤理化性质较差，生态环境恶劣，植物栽植后成活率不高，影响复垦效果。近年来，微生物菌剂修复凭借投入低、效果好、周期短、无二次污染等优势，在土地复垦领域倍受关注，应用前景广阔[7-8]。丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizalfungi，AMF）、哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum，TH）和胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus，BM）是土壤修复中常用的菌剂。AMF 能改善植物对磷、氮等养分的吸收，增强植物抗性，提高成活率和生长速度[9-10]。TH 是一种有益的真菌，具有促进植物重寄生、竞争、抗生以及提高抗病性等作用，能将土壤中的营养转化成植物易于吸收的成分[11]。BM 是可以分解土壤中硅酸盐矿物的异养型好氧细菌，具有解钾、解磷作用，并将其转化成供植物利用的有效养分，同时可分泌生长激素和酶类等物质促进植物生长发育[12-13]。以上菌剂均可通过提高根系吸收、固定、转化养分的能力，促进植物生长，改良土壤生态。单一菌剂的作用只能从某一方面提高复垦效果，有一定的不足之处，配施可使不同菌剂建立良性循环，将不同效用形成合力，大大提升复垦效应。

目前，国内现有研究多集中于单一微生物菌剂施用对土壤复垦效果的研究，以多类型功能菌为代表的微生物菌剂配施复垦技术在风蚀水蚀交错区的应用较少，其对土壤理化性质和酶活性的影响尚不明确。土壤理化指标和土壤酶种类繁多，单一指标在反应土壤质量变化上存在很大的片面性。将土壤理化指标和土壤酶活性运用加权和法计算土壤质量综合指数（SQI）和土壤酶指数（SEI），并以复垦前后土壤酶指数和土壤质量综合指数的变化率作为土壤酶恢复指数（ERI）和土壤养分恢复指数（NRI），可以客观、量化的揭示土壤的变化规律[14]。本研究以我国人工防护林典型树种小叶杨为复垦植物，通过比较AMF、BM、TH 三种菌剂联合复垦后土壤酶活性和理化性质的变化，探索不同微生物菌剂及配施方式对土壤理化性质和酶活性的影响，明确小叶杨与不同菌剂联合复垦技术对土壤的改良效果，为“植物 + 微生物菌剂”联合复垦技术应用提供理论参考。

1 研究区概况

研究区位于辽宁省阜新市彰武县苇子沟镇腰岭岗子村（42°26′15″ N，122°48′38″ E），地处科尔沁沙地的东南部，属半干旱区；风力强且集中，秋冬季节大风频发，易出现沙暴天气，平均风速3.7～4.6 m·s−1；雨热同期且时空分布不均，夏季降雨集中，易形成暴雨，年均降水量不足550 mm，是典型的风蚀水蚀交错区；该区年均气温5.7 ℃，最高气温35.2 ℃，最低气温−29.5 ℃，年蒸发量>1 200 mm，干燥度1.2～2.0，相对湿度50%～60%。土壤风蚀与水蚀严重，土壤类型为棕壤土，农耕地养分含量较低；土壤含水量14.02%，pH 值为6.3，土壤有机质含量为16.2 g·kg−1，土壤全N、全P和全K 含量分别为1.2、0.48、57.90 g·kg−1。区域内植物为典型的沙地灌草丛，如 欧 李（Semen pruniHumilis）、 锦 鸡 儿（Parochetus communisBuch）、羊茅（Festuca ovinaLinn.）、沙蓬（Agriophyllum squarrosumLinn.）、 差 巴 戈 蒿（Artemisia halodendronTurcz.）等，试验开始前已对地被植物进行人工清除。

2 研究方法

2.1 样地设置

本研究选用丛枝菌根真菌（AMF）、哈茨木霉菌（TH）和胶质芽孢杆菌（BM）作为试验菌剂，其中，TH、BM 购于绿陇生物，其菌剂浓度分别为1.0 × 1010、2.0 × 1010CFU·g−1；AMF 则选用了菌根效应优良的摩西球囊霉菌（Glomus mosseae），菌种购于石河子大学，菌种是内含真菌孢子、菌丝以及被浸染宿主植物根段等繁殖体的根际砂土混合物。试验设置菌剂单施、菌剂混施和对照3 个试验组，具体配置方式及菌剂施用量见表1。试验共分8 个处理，每处理3 次重复，每次重复设为1 个试验小区，共计24 个试验小区，进行随机区组设计。每个试验小区面积为2 m × 2 m，每小区内种植4 株小叶杨，株行距均为1.0 m ×1.0 m，为防止小区内微生物菌剂的迁移，各小区间设置2 m 隔离带。于2020 年3 月在各小区内种植2 年生（地径2～3 cm）小叶杨，在以定植点为中心30 cm 处将菌剂与土壤均混后进行埋施处理，并适时进行田间常规人工抚育管理，保证植物生长的良好性和均一性。

表1 实验设计及微生物菌剂施用量Table 1 Design of application and dosage of microbial agent in experimental

2.2 样品采集

在复垦处理90 d 后进行土壤采集，各试验小区内采用5 点取样法，采0～20 cm 土层土壤，同区土样混合均匀，去除覆土层可见的砂石、植物及动物残体等杂物，迅速过100 目（孔径1.5 mm）筛后将取好的土样用封口袋密封保存于冷藏箱带回实验室，1 份土壤4 ℃下保存，用于测定含水量、土壤酶活性等；另1 份土壤样品风干后研磨，用于测定土壤理化性质。

2.3 测定方法

2.3.1 理化性质测定 参考鲍士旦《土壤农化分析》[15]测定土壤理化性质，土壤含水量采用烘干法；土壤酸碱度（pH）采用电位法，以蒸馏水浸提土壤，液土比为5∶1；土壤电导率（EC）采用5∶1 浸提法；土壤有机质（SOM）采用低温外热重铬酸钾氧化—比色法[16]；土壤全氮（TN）采用凯式定氮分析仪测定；土壤全磷（TP）、全钾（TK）、钙（Ca）、镁（Mg）采用等离子体发射光谱仪（ICP-AES）测定。

2.3.2 土壤基础呼吸测定 采用室内密闭培养，1 mol·L−1NaOH 碱液吸收法测定[17]。

2.3.3 土壤酶活性测定[18]脲酶（URE）活性采用苯酚钠比色法；蔗糖酶（SUC）活性采用3,5-二硝基水杨酸比色法；过氧化氢酶（CAT）活性采用高锰酸钾滴定法；脱氢酶（DHA）活性采用TTC比色法。

2.4 土壤质量综合指数和土壤酶综合指数

在土壤中各指标测定值的基础上，采用加权和法计算土壤质量综合指数（SQI）和土壤酶综合指数（SEI），并将实测值转换为介于0～1 之间，实现指标标准化[19]。SEI计算公式如下：

式中：SEI为土壤酶指数；Wi为土壤酶i的权重；Vi为酶i活性的隶属度值；权重和隶属度参照许明祥等[19]的方法计算。SQI计算公式与SEI的计算方法一致。

2.5 土壤酶活性恢复指数（ERI）和土壤养分恢复指数（NRI）

用土壤酶活性恢复指数（ERI）[20]来评价复垦技术对土壤酶活性的影响，以未复垦裸地为对照，公式如下:

式中：A表示土壤SEI，下标R 为复垦区，D 为未复垦区。

土壤养分恢复指数(NRI)[21]以未复垦裸地对照，计算复垦区土壤SOM、TN、TP、TK、Ca、Mg与裸地间差异，以定量描述复垦对土壤养分的影响，公式如下：

式中：S为土壤的SQI，下标R 为复垦区，D 未复垦的裸地区。

2.6 数据分析与处理

数据整理、计算与作图均采用Microsoft Excel 2019 进行。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）对不同菌剂配施处理下土壤理化性质和酶活性进行差异显著性分析；使用“悟空”数据分析平台（https://www.omicsolution.com/wkomics/main/）的控件对酶活性与土壤理化因子进行冗余分析（RDA）。

3 结果与分析

3.1 不同菌剂配施下小叶杨复垦土壤的理化性质差异

表2 表明：不同处理的土壤含水量为15.60%～17.91%；土壤pH 值为6.32～6.58，各处理土壤pH 值均显著高于对照；电导率为65.35～128.60 mS·cm−1，除AMF + BM 和TH + BM 处理高于对照外，其他处理均显著低于对照；AMF 处理的土壤有机质含量最高，显著高于对照和其他处理，较对照提高了41.3%，其他处理与对照无显著差异；各处理土壤的TN 含量均高于对照，BM 处理最佳，较对照提高了19.1%，但与对照差异不显著；各处理土壤的TK 含量均低于对照，其中，TH、AMF + TH 和AMF+ TH + BM 处理与对照差异显著，分别降低了8.1%、11.2%和9.4%； AMF +BM 和AMF + TH 处理的土壤TP 含量较高，分别比对照显著提高了51.5%和53.0%；TH + BM 处理的Ca 含量最高，比对照显著提高了14.0%；AMF + BM 处理的Mg 含量最高，比对照显著提高了53.6%。各菌剂处理组的SQI均高于对照，其中，AMF + BM、AMF + TH + BM、BM 处理显著高于对照，分别提高了56.8%、36.4%和31.8%。总体而言，AMF + BM 处理土壤质量综合指数最优。

表2 不同处理对土壤理化性质及养分影响Table 2 Effects of different treatments on soil physicochemical properties and nutrients

3.2 不同菌剂配施对小叶杨复垦土壤呼吸和土壤酶活性的效应差异

图1 表明：所有处理均不同程度地提高了土壤呼吸，单施BM 处理的土壤呼吸最高，比对照显著提高了42.7%；混施中AMF + BM 和AMF + TH处理间土壤呼吸差异显著。

各菌剂处理的脲酶活性均显著高于对照，其中，AMF + BM 混施处理最高，比对照提高了34.8%（图1）。AMF、TH 单施和两菌混施的土壤蔗糖酶活性均显著高于对照，其中，单施AMF的效果最好，比对照显著提高了84.3%。单施AMF和TH 处理的土壤脱氢酶活性显著高于对照，AMF 处理比对照提高了39.7%。单施中，仅BM 处理的过氧化氢酶活性显著高于对照，提高了110.4%，混施中AMF + BM 处理过氧化氢酶活性最高，比对照显著提高了179.2%。

图1 不同处理对土壤呼吸及土壤酶活性的影响Fig. 1 Effects of different treatments on soil respiration and soil enzyme activities

各菌剂处理的土壤酶综合指数均显著提高，AMF + BM 的土壤酶指数最高，为0.84，比对照提高了1.33 倍；其次为BM 处理，为0.76，比对照提高了1.01 倍。除AMF + TH 和AMF + TH +BM 差异不显著外，其他各处理间均差异显著。

3.3 不同菌剂配施对土壤酶活性恢复指数和土壤养分恢复指数的影响

图2 表明：不同菌剂配施下，土壤酶活性恢复指数均高于对照，单施中，BM 处理的土壤酶活性恢复指数最大，为206.76%，是对照的4.56 倍；混施中，AMF + BM 处理的土壤酶活性恢复指数最大，为238.89%，是对照的5.27 倍，各混施处理的土壤酶活性恢复指数高低依次为AMF + BM >AMF + TH > AMF + TH + BM > TH + BM。

图2 不同处理对土壤酶活性恢复指数和养分恢复指数的影响Fig. 2 Effects of different treatments on soil enzyme activity recovery index and nutrient recovery index

菌剂配施不同程度的提升了土壤养分恢复指数，其变化范围为104.42%～178.15%，表明菌剂配施对土壤养分的恢复具有良好的促进作用（图2）。单施AMF、BM、TH 处理的土壤养分恢复指数分别为110.94%、104.42%和131.82%，以BM 处理的恢复效果最优； 混施中AMF + BM 处理土壤养分恢复指数最高，为178.15%，整体效果最优；不同处理土壤养分恢复指数的变化趋势与土壤酶活性恢复指数的规律基本一致。

3.4 不同菌剂配施下小叶杨土壤因子与土壤呼吸及酶活性的冗余分析

冗余分析结果可以更好的解释不同处理对土壤的理化性质与土壤呼吸及酶活性的影响，并反映各指标间的相关性。图3 显示：前2 个轴可以解释不同菌剂处理土壤的理化性质、土壤呼吸和酶活性关系变异78.46%的情况，其中，第1 排序轴的解释比例为42.85%，第2 排序轴为35.61%。AMF +BM 和TH + BM 两处理主要影响土壤Ca、Mg、TK含量，三种元素含量均与电导率呈正相关。AMF和TH 处理有效提高了土壤有机质含量，其含量与土壤脱氢酶和蔗糖酶活性显著相关。AMF + TH +BM、AMF + BM 和BM 三组处理综合复垦效应较好，主要影响pH、TP、含水量、过氧化氢酶、脲酶和土壤呼吸6 个指标。

注：BL 为裸地，DHA 为土壤脱氢酶，SUC 为蔗糖酶，URE 为脲酶，CAT 为过氧化氢酶。Notes： BL: bare land； DHA: Soil dehydrogenase； SUC:sucrase；URE：Urease；CAT：Catalase.

4 讨论

4.1 不同菌剂处理对土壤理化性质的影响

土壤理化性质与微生物活动和酶代谢密切相关，土壤既为微生物提供了的营养物质和生存环境，也受微生物的调控，微生物菌剂作为土壤改良剂，能够改善土壤的理化性质和养分状况[22-24]。本研究中，单施AMF 显著提升了土壤的有机质含量，与毕银丽等[25]的研究结果一致。AMF 能分泌土壤球囊霉素相关蛋白，对土壤有机碳的积累具有重要作用，从而促进了有机质的提高[26-27]；而单施AMF 会促进根系对N、P 等元素吸收[28]，尤其对P 的吸收，本研究中AMF 处理下土壤中的TP 含量显著低于CK 组。吕曼曼等[29]研究发现，与对照相比，木霉菌与杨树配施明显降低了土壤含水率，本研究中得到了相似的结果。原因可能是木霉菌促进了植物对养分的吸收，并增加土壤孔隙，引起土壤水分散失。BM 能显著提升土壤含水率，分解土壤矿物和岩石中的P 和K，且有一定的固氮能力，在本研究中都有所体现。三种菌剂单施处理中，BM 处理的土壤含水量、TN、TP 都最高[30]。

4.2 不同菌剂处理对土壤酶活性的影响

AMF 和TH 都能提高土壤脲酶和蔗糖酶活性，表明这2 种菌剂均能促进土壤的C、N 循环，促进物质周转，这与前人研究结果一致[31-33]。本研究中，AMF 和TH 处理显著提高了脱氢酶活性，表明这2 种菌剂能够促进土壤微生物活性；而BM 则对土壤脲酶和过氧化氢酶影响较大，可能是因为BM 能促进土壤团粒的形成，使土壤变得疏通、绵软，好氧微生物活性增强，进而提高了土壤过氧化氢酶活性[13,34]。

4.3 不同菌剂配施在土壤修复中的协同作用

AMF 和植物根际促生菌（Plant Growthpromoting rhizobacteria，PGPR）是植物根际有益的2 类微生物[35-36]，其中，AMF 侵染植物根系后形成菌根共生体，扩大根系吸收面积，促进养分的获取，提高抗逆性[37]。BM 和TH 是PGPR 的代表菌种，具有固氮、解磷、解钾功能，并产生植物激素、抗生素和拮抗病原菌。已有研究表明，AMF 与PGPR 具有协同修复土壤、促进植物营养吸收和生长的效应[38-39]。本课题前期研究发现，较单施AMF 相比，AMF + TH 混施对煤矸石基质的养分、微生物量及酶活性等都具有更显著的促进作用[40]。本研究中，AMF 与PGPR 搭配的AMF +BM 处理，土壤养分恢复指数和土壤酶活性恢复指均高于其他处理，表明BM 促进土壤养分的释放与AMF 提高植物对养分的吸收形成了高效的协同机制。冗余分析也显示，AMF + BM 主要影响土壤pH、TP、过氧化氢酶、脲酶和土壤呼吸等多个指标；而3 菌混施效果则低于AMF + BM 处理，原因可能在于3 菌之间产生了对于基质养分的竞争或存在一定程度的拮抗作用，对于形成本结果的机制机理有待于进一步的研究。

5 结论

菌剂单施处理中，BM 显著提高了土壤含水量，AMF 显著提高了土壤有机质含量；BM 和TH 单施显著提高了土壤呼吸，并高于对照；AMF、TH 单施显著提高了土壤蔗糖酶、脱氢酶活性。混施处理中，AMF + BM 主要影响土壤pH、TP、过氧化氢酶、脲酶和土壤呼吸等指标。总体而言，AMF 与PGPR 的配施形成了良好的协同效应，以AMF + BM 效果最佳，显著提升了土壤酶活性恢复指数和土壤养分恢复指数，且不同处理下土壤养分恢复指数的变化趋势与土壤酶活性恢复指数的规律基本一致，说明微生物双菌剂配施的联合效用显著提升了风蚀水蚀交错区的土壤复垦效果。