响应面法优化冰糖草总黄酮提取工艺及抗氧化活性分析*

陈丽珍，侯 杰，赵 珂，魏 娜，高丽玉，劳佳丽

海南医学院药学院，海南 海口 571199

冰糖草为玄参科野甘草属植物野甘草Scoparia dulcis L．的全草，又名野甘草、假枸杞、香仪、米碎草等。它是多年生草本植物，生长于热带和亚热带地区，我国主要分布在广西、广东、海南、福建、台湾等地。冰糖草性凉味甘，可全株入药，具有清热解毒，健胃疏风，镇咳止痒，利尿消肿的功效，常用于治疗肺热咳嗽、脚气浮肿、肠炎、高血压和湿疹热痱等病证［1-3］。在国外还用于治疗牙痛、淋病、糖尿病、胃病和肝机能障碍等［4-5］。已有文献［4，6］报道了冰糖草的化学成分、药理活性［4，7-8］、生药学［9］等方面的研究，发现其主要含有二萜类、黄酮类、生物碱等化学成分，具有降血糖血压、抗胃溃疡、抗菌、抗病毒、抗癌和治疗肝机能障碍等多种药理活性［3］，是一种很具开发应用前景的中草药。抗氧化剂可有效清除人体新陈代谢过程中产生的过量自由基，还可预防心脏疾病、癌症、老年痴呆症等多种疾病。自然界中，很多来源于植物的黄酮、酚类、多糖、皂苷类等都具有很好的抗氧化活性［10］。因此，从天然植物中提取开发新型安全有效的抗氧化剂已被广泛关注。然而，关于响应面法优化冰糖草总黄酮的提取工艺及其抗氧化活性方面的研究未见报道。为了更好地开发和利用丰富的冰糖草资源，本研究在单因素试验基础上，应用响应面法优化冰糖草总黄酮的提取工艺，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力和测定铁氰化钾还原能力的方法评价其抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 试药及仪器 冰糖草，采自海南省万宁市龙滚镇周边地区，经海南医学院药学院曾念开教授鉴定为玄参科植物野甘草Scoparia dulcis L.的全草，烘干，分离粉粹并过80 目筛，密封低温干燥避光保存备用；芦丁对照品（上海源叶，批号：B20771）；维生素C（Vc）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（上海阿拉丁，批号：Y01M7S10307）；其他试剂均为国产分析纯。SK3210HP 超声波清洗器（上海科导公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义予华公司）；RE-2000B 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DZF-6053 型真空干燥箱（上海一恒公司）；AE100 型电子分析天平（上海梅特勒-托利多公司）；UV-1600型紫外可见分光光度计（北京瑞利公司）；800C型台式离心机（上海安亭公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 绘制标准曲线［11-12］采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法。取7 个25 mL 容量瓶，分别精密量入0.246 mg/mL 的芦丁对照品溶液0、1、2、4、6、8 mL，分别加入5%NaNO2溶液1 mL，摇匀静置6 min；各加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀静置6 min；再加入4%NaOH 溶液4 mL，用蒸馏水定容，摇匀，放置15 min后在510 nm 处测定吸光值。以芦丁标准溶液的质量浓度C（ug/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，制得标准曲线及回归方程：A=10.677C-0.002 8，r=0.999 7，表明在9.8～78.7 ug/mL 测定浓度的线性关系良好。

1.2.2 冰糖草总黄酮的提取和含量测定 精密称取冰糖草粉末4.0 g于磨口三角瓶中，在设定的试验条件下按一定的乙醇体积分数、液料比、超声温度、超声时间和超声功率进行超声提取，固定提取次数为2次，抽滤，合并2次滤液，定容于容量瓶中，摇匀即得待测样品溶液。准确吸取一定量样品溶液置于25 mL 容量瓶中，按“1.3.1”项中的方法处理后测定吸光度，代入标准曲线回归方程计算总黄酮含量（W），结果以每克冰糖草干药草中含有相当芦丁的毫克数来表示（mg/g），计算公式为W=c×V×N/m，式中：c 为样品的吸光度代入回归方程计算得到的总黄酮浓度，mg/mL；N 为稀释倍数；V为提取液体积，mL；m为样品质量，g。

1.2.3 单因素试验 在下列设定好的提取条件下进行冰糖草总黄酮的提取，考察各因素对总黄酮提取量的影响。设定液料比25∶1 mL/g，提取温度为50℃，不同体积分数（40%、50%、60%、70%、80%、90%）的乙醇溶液为溶剂，超声功率为250 W，超声处理40 min；溶剂为70%乙醇溶液，液料比25∶1 mL/g，超声功率为250 W，置于不同温度（35、40、45、50、55、60℃）的水浴中超声处理40 min；提取温度50℃，溶剂为70%乙醇溶液，液料比25∶1 mL/g，超声功率为250 W，分别超声处理（20、40、60、80、100、120 min）；提取温度50℃，溶剂为70%乙醇溶液，液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g），超声功率为250 W，超声处理40 min。

1.2.4 响应面优化试验 在单因素试验基础上，根据Box-Benhnken 中心组合试验原理，选取乙醇体积分数（A）、液料比（B）、超声温度（C）为考察因素，以冰糖草总黄酮提取量为响应值，采用Design-Expert10.0 软件进行三因素三水平响应面法的设计与分析，由此优化得冰糖草总黄酮的最佳提取工艺条件。试验因素与水平如表1所示。

表1 响应面试验因素水平

1.2.5 抗氧化活性测定 将最佳工艺提取得到的总黄酮提取液，经减压浓缩后，真空干燥得到粗总黄酮粉。经减压浓缩至约原体积的1/4，加入4倍体积95%乙醇溶液，在4℃条件下过夜静置，抽滤，自然干燥，即得粗总黄酮粉。

1.2.5.1 清除DPPH 自由基能力的测定 用70%乙醇溶解配成1 mg/mL粗总黄酮样品溶液，并作梯度稀释。参照杨文平等［13］的方法并适当改进。DPPH 乙醇溶液浓度为50 ug/mL。分别在2 mL DPPH 溶液中加入1.0 mL 梯度质量浓度的样品溶液，混匀，暗处室温放置30 min 后，于517 nm 处测定吸光度，即为A1；在3 mL DPPH 溶液中加入1 mL的样品溶剂作空白对照，同样条件下测定吸光度，即为A0；同时以Vc作为阳性对照。

1.2.5.2 还原能力的测定 用70%乙醇溶解配成1 mg/mL粗总黄酮样品溶液，并作梯度稀释。参照BERKER［14］方法略作修改，分别吸取梯度质量浓度1 mL置于10 mL离心管，再加入0.2 mol/L pH 6.6磷酸盐缓冲液2 mL 和1%铁氰化钾1 mL。混匀置于50℃水浴保温20 min，迅速冷却后加入10%三氯乙酸2 mL，混匀，4000 r/min 离心10 min。取上清液4 mL，加入蒸馏水1 mL 和0.1%的三氯化铁水溶液0.5 mL，混匀静置10 min，以蒸馏水作空白参比，在700 nm处测定吸光度值，并与相同浓度Vc的还原力进行比较。吸光值越大表示还原能力越强。

1.3 统计学方法采用Excel 2010、GraphPad Prism 8.0.2 和Design-Expert10.0 软 件 进 行 数据处理与分析。

2 结果

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响 总黄酮提取量随着乙醇体积分数的增加而上升，当乙醇体积分数达到70%时，提取量最大，之后开始呈下降趋势。这是可能因为随着乙醇体积分数的增加，溶剂对物料的渗透性和对细胞膜的破坏性随之增大［15］，提高了黄酮类成分的溶出率；而继续增加体积分数使得其他醇溶性成分溶出量增多［16］，反而降低了提取量。故乙醇体积分数以70%为宜。见图1。

图1 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响

2.1.2 液料比对总黄酮提取量的影响 总黄酮提取量随着提取剂用量的增加而呈上升趋势，当液料比达到30∶1 mL/g 时，提取量最大，之后继续增加溶剂用量，提取量反而呈下降趋势。这可能是因为在一定范围内，溶剂用量增加，溶质的分散程度好，接触面积大［17］，有利于黄酮类成分的溶出。当溶剂用量进一步增加时，黄酮类成分溶出趋于饱和，反而促使其他杂质的溶出，使得提取量下降。故液料比以30∶1 mL/g为宜。见图2。

图2 液料比对总黄酮提取量的影响

2.1.3 超声温度对总黄酮提取量的影响 随着提取温度升高，总黄酮提取量呈上升趋势，当提取温度达到55℃时，提取量最大，之后升高温度反而使得提取量下降。这可能是因为随着温度升高，加速了黄酮类成分的渗透，增加溶解速度和扩散作用［17］，促使溶出。但温度过高，会导致部分受热不稳定的黄酮物质氧化和降解［18］，降低提取量。故超声提取温度不宜超过55℃。见图3。

图3 超声温度对总黄酮提取量影响

2.1.4 超声时间对总黄酮提取量的影响 随着超声提取时间的延长，总黄酮提取量变化不大，但当超声提取时间为80 min时，提取量最大，随后提取量呈缓慢下降趋势。这可能是由于当超声时间达到80 min，黄酮类成分已基本完全溶出，继续延长时间，有可能使黄酮类成分发生降解或也伴随着其他杂质的溶出［15］，导致提取量下降。故超声提取时间以80 min为宜。见图4。

图4 超声时间对总黄酮提取量影响

2.1.5 超声功率对总黄酮提取量的影响 当超声功率在125～225 W 范围内，随着超声功率的增大，总黄酮提取量增加很缓慢，变化不大，而当功率从225 W增加至250 W时，提取量上升较快，且在250 W 时达到最大值。这可能是因为随着超声功率增大，超声波增加了物料细胞的破碎程度与渗透性［17］，促使黄酮类成分的溶出。故超声功率以250 W为宜。见图5。

图5 超声功率对总黄酮提取量的影响

2.2 响应面试验结果

2.2.1 试验设计及结果 响应面试验方案及结果见表2。

2.2.2 回归方程方差分析 对表2数据进行回归分析，建立提取工艺参数回归模型，得回归方程为：Y=36.45+1.31A+1.37B+0.54C+0.56AB-1.85AC-1.32BC-2.48A2-4.15B2-2.88C2。

方差分析结果如表3所示。回归模型的F值为71.41，P＜0.000 1（极显著），失拟项P=0.092 8＞0.05（不显著），决定系数R2=0.989 2，校正系数RAdj2=0.975 4，表明模型拟合试验结果良好，试验值与预测值相关性高，有近98%的真实值可由该模型预测，有97%的试验结果受试验因素的影响。因此所建模型可靠，可用于分析和预测总黄酮提取的结果。通过比较F值的大小，判断各因素对总黄酮提取量影响的主次顺序为乙醇体积分数＞液料比＞超声温度；由P值及显著性结果可知，对总黄酮提取量的影响达到极显著的因素有一次项A、B、C及二次项A2、B2、C2，交互项AC、BC对总黄酮提取量的影响达到显著。见表2—3。

表2 响应面试验设计及结果

表3 回归方程方差分析

2.2.3 响应曲面分析 由所得的回归模型作出相应的响应曲面图，可进一步直观反映各试验因素对响应值影响的两两交互作用及相对显著性。响应面坡度越陡，表明因素对响应值的影响越大；反之则其影响越小［15］。在交互项对提取量的影响中，液料比与超声温度和超声时间与超声功率之间交互作用显著，其他因素之间交互作用不显著，这与方差分析的结果一致。见图6。

图6 各因素交互作用对总黄酮提取量的响应曲面

2.3 最佳提取工艺及验证应用Design Expert 10.0 软件进行工艺参数的优化分析，得到预测的冰糖草总黄酮提取的最佳工艺参数为乙醇体积分数71.93%，液料比31.52∶1 mL/g，超声温度54.76℃，提取量可达到36.77 mg/g。为验证模型有效性，考虑到实际操作将冰糖草总黄酮的最佳提取工艺参数调整为乙醇体积分数72%、料液比32∶1 mL/g、提取温度55℃。在此条件下平行提取5 次，所得到提取量为36.82 mg/g，与预测值接近，表明该模型可靠，优化所得工艺可行。

2.4 体外抗氧化活性结果在测定的质量浓度范围内，冰糖草总黄酮具有抗氧化活性，且随着质量浓度的增加而呈现增强趋势，呈现明显的量效关系。由图7（a）可知，在2.12～10.60µg/mL的相同浓度内，冰糖草总黄酮和Vc对DPPH自由基的清除率均随着浓度的升高而增强，分别为总黄酮26.69%～80.15%和Vc 21.58%～70.24%；由GraphPad Prism 8.0.2 处理得IC50为总黄酮4.23 ug/mL、Vc 5.54 ug/mL。整体上总黄酮的清除能力高于Vc，表明冰糖草总黄酮具有较强的清除能力。由图7（b）可知，在1.43～7.15 ug/mL 的相同浓度内，冰糖草总黄酮与Vc 的吸光值都随质量浓度的增加而增大，分别为总黄酮0.363～0.885和Vc 0.218～0.821，还原能力也明显增强，而整体上总黄酮的还原能力略低于Vc，但仍说明冰糖草总黄酮具有一定的还原能力。见图7。

图7 冰糖草总黄酮抗氧化活性

3 小结

以冰糖草为原料，乙醇溶液为溶剂，在单因素试验的基础上，通过响应面法对超声辅助提取冰糖草总黄酮的工艺进行优化，确定最佳工艺条件为：采用响应面法考察冰糖草总黄酮提取量的影响因素，优化得到冰糖草总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇体积分数72%、料液比32∶1 mL/g、提取温度55℃。得到冰糖总黄酮含量为36.82 mg/g，与模型预测值36.77 mg/g 较接近，表明建立的模型可靠，该提取工艺稳定合理，是提取冰糖草总黄酮的可行方法。抗氧化活性测定结果显示，冰糖草总黄酮对DPPH 自由基有较好的清除能力及还原能力，表明冰糖草总黄酮具有较好的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂资源。该研究为冰糖草的进一步开发及天然抗氧化剂的应用提供了理论依据。同时冰糖草总黄酮的体内抗氧化活性及其具体化学成分的分离纯化有待下一步研究。