肠吉泰对肠易激综合征内脏高敏感大鼠PAR2、PKCε、TRPV1 蛋白表达的影响*

耿 琦，丛 军

上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种功能性肠病，临床以反复发作的腹痛，伴排便频次或大便性状改变为主要表现［1］。据一项来自Rome 委员会的系统综述（包含83 项研究，涉及41 个国家）显示，全球IBS 的总体患病率为8.8%，亚洲患病率为9.6%，占消化科门诊的25%～50%，每年发生的直接医疗费用为13.5 亿美元，间接花费为2.05 千万美元［2-3］。腹痛是IBS 患者最为常见的不适主诉，内脏感觉高敏则是IBS 的一项重要病理生理学征候，其发生机理目前尚不十分明确［4］。而目前治疗内脏疼痛的药物有限，针对躯体疼痛治疗的药物副作用大，因此对内脏痛敏神经生理机制的研究，将有助于寻找新的治疗靶点。

肠吉泰是全国名中医蔡淦教授治疗IBS 的经验方，具有疏肝健脾、缓急止泻的功效。前期RCT临床研究结果表明，肠吉泰对镇痛止泻有效，对改善患者粪便性状、减少每天排便次数、减轻急迫症状、减轻腹胀程度均有较为显著的治疗作用［5］。我们经过更进一步的实验研究发现［6-7］，肠吉泰方可以减少IBS 内脏高敏感模型大鼠结肠黏膜内肥大细胞数目，从而有效控制肥大细胞受P 物质刺激后的脱颗粒状态；使得IBS 模型大鼠结肠黏膜TRPV1 mRNA 的表达降低，改善内脏痛觉敏感。近年来国内外研究表明，PAR2、PKCε是TRPV1敏化介导的内脏高敏感性的关键之一，为了深入研究内脏高敏感IBS 模型大鼠镇痛作用机制，本研究拟从PAR2、PKCε 蛋白的变化角度，观察肠吉泰对内脏高敏感IBS大鼠镇痛作用的疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性新生SD 大鼠，SPF 级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK（2017-0005）。每笼饲养10 只新生大鼠和1只哺乳期母鼠。大鼠出生后第35天与母鼠分离并分笼饲养，每笼5只。

1.2 药物及仪器肠吉泰（药物组成：炒白术、白芍、陈皮、防风、乌梅、甘草等），由曙光医院中药制剂中心采用水提法制成浓度为0.423 g/mL 的溶液。TRPV1 阻 断 剂capsazepine（美 国abcam，批号：ab120025）。PAR2 抗体（1∶1000，Abcam，批号：ab180953），p-TRPV1 抗体（1∶1000，Abnova，批号：PAB8499），TRPV1 抗 体（1∶1000，NOVUS，批 号：NB100-1617），PKCε 抗 体（CST，批 号：2683，1∶1000）。酶标仪（MK3，THERMO 公司）；thiss-24 型组织碾磨仪（上海净信）；MIKRO220R 型低温高速离心机（Hettich 公司）；DNP9082 型恒温孵育箱（精宏公司）；MDF-382 型-80℃冰箱（Panasonic 公司）；1658033 型电泳仪（美国伯乐）；IMS-25 型制冰机（常熟雪科）；ChemiQ4600 型荧光化学发光成像系统（上海勤翔仪器公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及造模 新生大鼠40 只，按照随机数字表法随机分为空白组、模型对照组、阳性对照组和肠吉泰组，每组10 只。参照Alchaer 直肠醋酸刺激法制造IBS 模型［8］：乳鼠在出生第8 天即采用直肠内注入醋酸的方法进行刺激，使用冰醋酸配置0.5%的醋酸溶液，以连续硬膜外导管连接注射器经石蜡油润滑插入大鼠肛门直肠2 cm，缓慢注入0.5%醋酸溶液1 mL，保留20 s。除空白组外，其余3组大鼠连续造模14天。

1.3.2 给药方法 造模期间阳性对照组大鼠给予腹腔注射Capsazepine（2 mg/kg，醋酸刺激前30 min），其余各组除空白组外均给予相同体积的溶剂腹腔注射。从第8 周开始，肠吉泰组按0.423 g/（mL·d）的剂量给予肠吉泰中药灌胃，其他组每日予以等量去离子水灌胃，持续灌胃4周。

1.4 观察指标

1.4.1 检测大鼠肠道敏感性 采用结直肠气囊扩张法行肠道敏感性评估。用异氟烷气麻后，将气囊用甘油润滑后经肛门插入约5 cm，用胶布把导管与鼠尾固定，置透明器具内，大鼠不能转身，但不影响抬腹等动作。待大鼠苏醒适应10 min 后，进行肠道扩张检测，压力分别为20、40、60、80 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa），每次持续20 s，通过观察大鼠腹壁反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）情况评估各组大鼠的肠道敏感性，并记录评分。对每一压力值都重复进行3次扩张，每次扩张间隔4 min，取3次测量所得压力值的均数作为检测值。

1.4.2 检测大鼠结肠黏膜组织PAR2、PKCεTRPV1、p-TRPV1表达值 取结肠黏膜组织加入含蛋白酶等抑制剂的裂解液经组织碾磨仪碾磨后提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，蛋白变性，经凝胶电泳（SDS-PAGE）分离目的蛋白，湿转后，用TBST 溶液清洗后封闭2 h，加入一抗，4℃孵育过夜，加入二抗室温下孵育1 h，电化学发光显色后置于凝胶成像仪中分析蛋白表达情况，采用Image 软件评估各个蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，计量资料采用xˉ±s表示，组间变量比较采用单因素方差分析，经正态分布检验，如果方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Tamhane’s T2法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠内脏敏感性当气囊压力为40、60 mm Hg时，模型对照组大鼠AWR 评分较空白组明显升高（P＜0.01），提示内脏敏感性升高；肠吉泰组和阳性对照组AWR 评分与模型对照组比较均明显降低（P＜0.05）。肠吉泰组AWR 评分与阳性对照组无明显差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠AWR评分比较（±s） 分

表1 各组大鼠AWR评分比较（±s） 分

注：空白组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与模型对照组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

组别空白组模型对照组阳性对照组肠吉泰组鼠数10 10 10 10气囊压20 mm Hg 0.500±0.527 0.800±0.789 0.600±0.699 0.800±0.789 40 mm Hg 1.700±0.675 2.800±0.632**2.000±0.816△1.800±0.632△△60 mm Hg 2.700±0.675 3.800±0.422**3.000±0.816△△3.100±0.568△80 mm Hg 3.500±0.527 3.900±0.316 3.700±0.483 3.900±0.316

2.2 大鼠结肠黏膜组织PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1的表达与空白组比较，模型对照组PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1的表达显著升高（P＜0.05）。与模型对照组比较，阳性对照组及肠吉泰组PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1的表达均显著降低（P＜0.05）。见图1—2。

图2 各组大鼠PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1蛋白表达

3 讨论

IBS 内脏高敏感属祖国医学“痛泻”范畴。本病病机为脾虚肝乘，肝脾不和，运化失常所致。《丹溪心法》之痛泻药方乃治疗“痛泻”的经典方剂，由陈皮、白术、白芍、防风组成。上海中医药大学附属曙光医院全国名中医蔡淦教授根据“痛责之肝；肝责之实”的理论，在痛泻药方的基础上加入甘草、乌梅两味药，即构成“肠吉泰”组方。方中甘草配伍芍药即《伤寒论》芍药甘草汤，具有调和肝脾、缓急止痛之功效；而乌梅味酸，入肝脾二经，与甘草合用，可酸甘化阴，亦可益肝阴。全方共奏疏肝健脾，缓急止泻之效，治疗IBS疗效满意［5］。

前期动物实验研究［6-7］证实，肠吉泰方可以减少IBS 内脏高敏感模型大鼠结肠黏膜内肥大细胞数目，从而有效控制肥大细胞受P 物质刺激后脱颗粒状态；使得IBS模型大鼠结肠黏膜TRPV1 mRNA的表达降低，改善内脏痛觉敏感。

新近研究发现，PAR2、PKCε 在TRPV1 敏化介导的内脏高敏感性导致IBS 的过程中扮演着重要的角色。PAR2 广泛表达于胃肠组织的上皮细胞、平滑肌细胞及相关的神经、免疫系统的细胞，通过感知兴奋感觉神经元，激发神经源性疼痛［8-11］。PKCε是蛋白激酶C（protein kinaseC，PKC）家族中的一种亚型，其可通过磷酸化TRPV1 降低离子通道开放阈值而在痛觉敏感中发挥重要的作用［12］。IBS 患者肠道存在肥大细胞（mast cell，MC）增多及PAR2的过度表达［13］。IBS活检组织样本的分析结果显示，胃肠道MC 数量平均增加1.2～2.5 倍，提示IBS 患者黏膜存在MC 增生，通过透射电子显微镜上的过敏性脱颗粒的超微结构特征显示，MCs在IBS 中的盲肠和直肠中具有更高的活化率［14］。当MC 被活化并脱颗粒后，释放大量胰蛋白酶、类胰蛋白酶等，可激活自身PAR2 进行伤害信号放大，同时类胰蛋白酶剪切并结合PAR2，激活下游磷酸酯酶Cβ（phosopholipase Cβ，PLC），将膜上的脂酰肌醇4，5-二磷酸（phosphatidylinositol biphosphate，PIP2）分解为二酰甘油（diacylgycerol，DAG）和1，4，5-三磷酸肌醇（IP3），IP3 动员细胞内钙库释放Ca2+到细胞质中与钙调蛋白结合，而DAG 在Ca2+的协同下激活PKCε，PKCε 活化可致敏TRPV1 受体，使其发生磷酸化，Ca2+内流增加，导致胞膜去极化，引起神经元的兴奋，释放伤害性神经递质SP 与降钙素基因相关肽（calcitoningene-related peptide，CGRP），引起内脏疼痛感知异常，最终导致内脏高敏感性的发生［15-18］。因此，抑制PAR2、PKCε 可下调TRPV1 的表达，从而减少伤害性神经递质的释放，降低内脏敏感。

本研究结果表明，肠吉泰对模型大鼠结肠黏膜组织中PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1 的表达有显著下调作用，提示肠吉泰可能是通过下调PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1 的表达，抑制其活化，改善IBS的内脏高敏感状态，从而取得镇痛的疗效。