新型冠状病毒变异谱系的研究进展

顾望 于世寰

作者单位：150001 黑龙江 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第一医院呼吸内科

新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎，COVID19)是由新型冠状病毒(2019-nCoV)感染引发的急性呼吸道传染病，目前已成为全球性重大的公共卫生事件，截至2021年8月25日，世界卫生组织报告了213050725例新冠肺炎确诊病例，其中包括44483528例死亡病例[1]。 随着新型冠状病毒的全球传播，导致全球范围内大量新型冠状病毒变异谱系出现,一起谱系的出现引发了广泛的担忧，如B.1.1.7(Alpha)谱系、B.1.351(Beta)谱系、P.1(Gamma)谱系、B.1.167.2(Delta)谱系、B.1.429(Epsilon)谱系、B.1.526(Iota)谱系。新型冠状病毒通过刺突蛋白感染靶细胞，刺突蛋白是抗体的主要靶点，新的病毒谱系在刺突蛋白的突变使得新型冠状病毒传播性增强、疾病严重程度增加以及产生免疫逃避，同时对目前已有一些治疗手段产生重要的影响。本文将对新型冠状病毒变异谱系的研究进展进行综述。

新型冠状病毒及变异谱系的结构

一、新型冠状病毒的结构

新型冠状病毒属于β属的冠状病毒，由刺突蛋白(S)、核蛋白(N)、病毒包膜(E)、基质蛋白(M)和核糖核酸组成[2]。冠状病毒的刺突蛋白是一种同源三聚体，每个单体包括一个S1亚单位和一个S2亚单位，S1亚单位包含受体结合区(Receptor Bin-ding Domain, RBD)、N末端结构域(N-terminal domain NTD)及两个C末端结构域(C-terminal domains CTDs)。RBD与受体血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)结合，S2亚单位介导膜融合[3-4]。

二、新型冠状病毒感染宿主细胞过程

新型冠状病毒通过刺突蛋白感染靶细胞，刺突蛋白首先作为单链前体被合成，然后被furin样蛋白酶加工成受体识别片段S1和融合片段S2[5]。在S1的RBD与ACE2结合的同时S2被另一种蛋白酶进行第二次水解切割，这导致S1的解离和S2不可逆的重折叠成融合后状态，最终导致膜融合[6-7]。在这个过程中，依赖丝氨酸蛋白酶TMPRSS2启动刺突蛋白[8]，神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1，NRP1)可以促进刺突蛋白与ACE2的相互作用来增强感染性[9]。

三、新型冠状病毒变异谱系的刺突蛋白突变

新型冠状病毒的全球传播导致全球范围内大量病毒谱系的出现。新型冠状病毒首先出现的突变是刺突蛋白614位氨基酸由甘氨酸取代天冬氨酸(D614G)，这种突变防止刺突蛋白三聚体过早的解离，有效的增加了功能性S蛋白数量，并调节了膜融合结构重排[10]。D614G突变使得新型冠状病毒的传染性和稳定性增强，感染D614G突变体的新冠肺炎患者上呼吸道病毒载量增高，增加了传播能力，但是与疾病的严重程度无关[11-12]。随着新冠肺炎大流行的蔓延，D614G突变更加普遍,到2020年6月，超过74%的已公布序列出现D614G突变。

B.1.1.7谱系是2020年9月在英国首次发现变体，除了在刺突蛋白上具有D614G突变外，B.1.1.7谱系在刺突蛋白RBD结合位点中第501位氨基酸由络氨酸取代天冬酰胺(N501Y),在NTD中69位组氨酸、70位缬氨酸、144位酪氨酸缺失，B.1.1.7谱系在刺突蛋白中还存在其他突变，刺突蛋白中570位氨基酸由天冬氨酸取代丙氨酸(A570D)、第681位氨基酸由组氨酸取代脯氨酸(P681H)、第716位氨基酸由异亮氨酸取代苏氨酸(T716I)、第982位氨基酸由天冬氨酸取代丝氨酸(S982A)、第1118位氨基酸由组氨酸取代天冬氨酸(D1118H)。但是B.1.1.7谱系在RBD和NTD中的突变没有引起重大的结构重组。其中N501Y突变使得RBD与ACE2的亲和力增加，无论ACE2寡聚状态如何。A570D、S982A突变使得RBD更好的呈现受体结合序列至ACE2，增强的受体序列呈现和亲和力增加可能允许B.1.1.7谱系感染比鼻和支气管上皮细胞更低ACE2水平的细胞，扩大的细胞趋向性可能是患者死亡风险增加的原因，B.1.1.7谱系不仅更容易传播，还能导致更严重感染[13-15]。而在NTD上的第144位氨基酸的丢失虽然没有引起重大结构重排，却导致对大部分抗NTD的单克隆抗体产生耐药性[16]。

B.1.351谱系首次发现于南非，在刺突蛋白中除了D614G突变，B.1.351谱系在RBD中第417位氨基酸由天冬酰胺取代了赖氨酸(K417N)、第484位氨基酸由赖氨酸取代了谷氨酸(E484K)、N501Y。在NTD中第18位氨基酸由苯丙氨酸取代亮氨酸(L18F)、第80位氨基酸由丙氨酸取代天冬氨酸(D80A)、第215位氨基酸由甘氨酸取代天冬氨酸(D215G)，同时在刺突蛋白中还存在第242位亮氨酸、第243位丙氨酸、第244位亮氨酸的丢失[17]。B.1.351谱系刺突蛋白对单体ACE2的亲和力更高，对二聚体ACE2的亲和力稍低。B.1.1.7谱系RBD中N501Y突变增强了受体识别，但是B.1.351谱系的额外K417N突变和E484K突变使得RBD与ACE2结合力降低到与D614G变体相同水平,对ACE2亲和力低于B.1.1.7谱系。B.1.351谱系RBD中的突变并未引起主要结构的变化，但是E484K和K417N突变产生了免疫逃避，有助于抵抗针对RBD的单克隆抗体的中和，NTD中的中L18F突变以及第242位亮氨酸、第243位丙氨酸、第244位亮氨酸的丢失引起NTD抗原表位的重排，大大降低了针对NTD单克隆抗体的效力[14-16,18]。

P.1谱系由B.1.1.28谱系分支而来，B.1.1.28谱系首次发现于巴西，与B.1.351谱系共享了K417N、E484K、N501Y突变，P.1谱系RBD中第417位氨基酸由苏氨酸取代了赖氨酸(K417T)，同时保留了E484K、N501Y突变。P.1谱系在NTD中存在L18F突变、第20位氨基酸由天冬酰胺取代苏氨酸(T20N)、第26位氨基酸由丝氨酸取代脯氨酸(P26S)、第138位氨基酸由酪氨酸取代天冬氨酸(D138Y)、第190位氨基酸由丝氨酸取代精氨酸(R190S)突变。P.1谱系在与ACE2亲和力方面与B.1.351谱系相似，同时也抵抗针对RBD及NTD的单克隆抗体的中和。

B.1.167谱系首次在印度被报道，但已经全球传播，其中B.1.167.2谱系备受关注，在2020年12月在印度首次被检测到。B.1.167.2谱系同样存在D614G突变，此外在刺突蛋白中RBD中存在第452位氨基酸由精氨酸取代亮氨酸(L452R)、第478位氨基酸由赖氨酸取代苏氨酸(T478K)，在NTD中第19位氨基酸由精氨酸取代苏氨酸(T19R)、第142位氨基酸由天冬氨酸取代甘氨酸(G142D)、第156位和157位氨基酸缺失、第152位氨基酸由甘氨酸取代精氨酸(R158G)。其中L452R突变与B.1.167.2谱系传染性增加相关，同时降低了恢复期血浆及特异性单克隆抗体的中和作用,L452R突变在B.1.427/B.1.429谱系中被发现[19]。

B.1.429谱系首次发现于美国，B.1.429谱系刺突蛋白RBD中存在L452R突变、NTD中第13位氨基酸由异亮氨酸取代丝氨酸(S13I)、第152位氨基酸由半胱氨酸取代色氨酸(W152C)。L452R突变同样使得B.1.429谱系的传染性增加，同时降低针对RBD单克隆抗体的中和作用。B.1.429谱系的S13I、W152C突变使得针对NTD的活性降低，但是并没有使得传染性增加[19-20]。

B.1.526谱系在2021年初的感染率迅速上升，其在刺突蛋白上存在E484K突变，B.1.526谱系的子谱系B.1.526.1存在L452R突变，子谱系B.1.526.2在刺突蛋白上第477位氨基酸由天冬酰胺取代丝氨酸(S477N)。B.1.526谱系和B.1.526.2谱系刺突蛋白共同存在第5位氨基酸由苯丙氨酸取代亮氨酸(L5F)、第95位氨基酸由异亮氨酸取代苏氨酸(T95I)、第253位氨基酸由甘氨酸取代天冬氨酸(D253G)、D614G、第701位氨基酸缬氨酸取代丙氨酸(A701V)或第957位氨基酸由精氨酸取代谷氨酰胺(Q957R)。S477N突变并没有引起抗RBD单克隆抗体、恢复期血浆、疫苗血清的中和活性的变化[21-22]。

新型冠状病毒变异谱系对治疗的影响

一、恢复期血浆

新冠肺炎康复患者的恢复期血浆作为被动免疫转移的一种方法，有望成为治疗新冠肺炎的重要手段，并且在临床实验外被广泛使用。恢复期血浆中免疫球蛋白IgG大部分通过与S2亚单位、NTD结合起到中和新型冠状病毒的作用，小部分通过与RBD结合中和新型冠状病毒[23]。不同的新型冠状病毒谱系在刺突蛋白中获得的突变，使得病毒对于恢复期血浆产生了免疫逃避。早期感染新型冠状病毒的患者的恢复期血浆对于野生型新冠病毒有着中和活性，同时也对B.1.1.7谱系保持了中和活性，但是对于B.1.351谱系的中和活性出现了显著的降低[16]。即使恢复期血浆对于野生型病毒、B.1.1.7谱系保持中和活性，但是在一项随机、对照、开放的临床实验中，RECOVERY协作组发现对于重型新冠肺炎患者接受恢复期血浆治疗并不能降低28天死亡率、出院时间[24]。一项发表于新英格兰杂志的研究结果与RECOVERY协作组相一致，同时观察到，在未接受机械通气新冠肺炎患者中，输注抗体水平高的血浆的患者死亡风险比输注抗体水平低的血浆患者的死亡风险更低，但是在该研究中并没有考虑到新的病毒变体的影响[25]。对于B.1.167.2谱系和B.1.429谱系，与B.1.351谱系类似，恢复期血浆的中和活性同样出现下降[26]。但是，恢复期血浆对于新的病毒变体的效果仍缺乏临床实验佐证。

二、抗新型冠状病毒单克隆抗体

新冠肺炎的大流行已在全球产生广泛影响，需要制定有效的干预措施来结束这一流行病，使用单克隆抗体的单一和联合疗法已获得紧急使用授权。单克隆抗体得针对得主要靶点是RBD和NTD，但是新的病毒变体在刺突蛋白上的突变引发了人们对单克隆抗体疗效的担忧。LY-CoV555、LY-CoV016、REGN10933、REGN10987这四种单克隆抗体获得临床批准，其目标靶点是RBD。对于B.1.1.7谱系，LY-CoV555失去了抗病毒活性，LY-CoV016、REGN10933、REGN10987仍保持活性。对于B.1.351谱系，LY-CoV555单独或与LY-CoV016组合对于B.1.351谱系无活性，REGN1933中和活性受损,但是REGN10933和REGN10987的组合保留大部分中和活性。这四种抗RBD单克隆抗体对于B.1.167.2谱系的效果与对B.1.1.7谱系类似。对于B.1.429谱系，LY-CoV016显示中和活性的降低，LY-CoV555完全失去中和活性，而REGN1933和REGN10987组合的中和活性不受影响[20,27-28]。

三、新型冠状病毒疫苗

新型冠状病毒疫苗通过诱导特异性抗体的产生，从而达到抵抗病毒保护机体的作用，可用于预防感染或降低疾病严重程度。疫苗正在被广泛接种，但是新的病毒谱系在不断出现。来自接种个体的血清对于B.1.1.7谱系的中和活性基本完整，但是对于B.1.351谱系，其中和活性损失较大,接受两剂BNT162b2疫苗对B.1.351谱系的有效性为75%，接种两剂ChAdOx1 nCoV-19疫苗对于B.1.351谱系，在预防轻度至中度新冠肺炎方面没有效果,同样mRNA-1273疫苗诱导的血浆抗体对于B.1.351谱系的中和效力也明显下降[16,29-32]。对于B.1.167.2谱系，接种两剂BNT162b2疫苗的有效性约为88%，接种两剂ChAdOx1 nCoV-19疫苗的有效性约为67%[33]。对于B.1.429谱系，有实验表明，相较于D614突变体，BNT162b2疫苗诱导的血浆抗体的平均中和效力下降2.3倍，mRNA-1273疫苗诱导的血浆抗体的平均中和效力下降下降2.4倍[20]。

讨 论

新型冠状病毒在全球范围内大流行，每天大量的复制事件使得新的病毒谱系的出现不可避免，并大大增加了病毒的遗传多样性。对于不断出现的新的病毒谱系，进行基因序列监测相当重要，还需要理解变异病毒谱系产生免疫逃避的结构基础。同时新型冠状病毒变异谱系使得目前治疗手段应接不暇，这可能要求我们研发的单克隆抗体及疫苗需要针对新型冠状病毒更加稳定的靶点。