支气管镜在菌阴肺结核诊断中应用价值

王燕波 胡阳 宋宁 贾守杰 魏存乐 丁卫民

肺结核是严重影响人民身体健康的传染性疾病，已成为严重的社会公共卫生问题[1]。肺结核(肺脏、气管支气管及胸膜结核)虽为临床常见病、多发病，但因临床上近几年来对结核病的忽视，加之菌阴结核病大量存在，肺结核多被误诊误治，明确诊断时多已为重症结核[2]。支气管镜可以直接观察气道局部病变，并通过活检、刷检、冲洗、灌洗等，取得气道肺标本，进行结核分枝杆菌病原学、病理学及分子生物学检测，对肺结核尤其是菌阴结核确诊，提供了帮助[3]。为探讨支气管镜在菌阴肺结核临床诊断价值，本次研究对我院862例菌阴肺结核患者，进行了回顾性分析，现报告如下。

资料与方法

一、一般资料

选取2018年6月至2020年12月大同市第四人民医院862例菌阴肺结核患者作为本次研究对象进行回顾性分析，其中男性332例，占比38.52%，女性530例，占比61.48%，患者年龄18～60岁，平均年龄(42.5±3.3)岁。本研究经医院伦理委员会批准(批准号：2021003)，所有患者均签署知情同意书。

菌阴肺结核诊断参考相关标准[4]：①典型肺结核临床症状和胸部X线表现；②抗结核治疗有效；③临床可排除其他非结核性肺部疾患；④PPD(5iu)强阳性、血清结核抗体阳性；⑤痰结核分枝杆菌PCR +探针检测阳性；⑥肺外组织病理证实结核病变；⑦BALF检出抗酸菌；⑧支气管或肺组织病理证实结核病变。具备1～6中3项，或7～8中任何一项可确诊。除外气管支气管结核及结核性胸膜炎。

二、标本留取及检测方法

1.标本留取：① 痰液留取：镜检前及镜检后当时嘱患者进行深呼吸，并尽量收集其由肺部深处咳出分泌物。②电子支气管镜检查及取样：使用潘太克斯EB-1975K型及奥林巴斯290系列支气管镜进行支气管镜检查。针对肺部病灶部位进行冲洗检查，取得冲洗液标本。

2.检测方法：冲洗液离心后分别行抗酸染色镜检找抗酸杆菌、结核分枝杆菌BD-960快速培养、罗氏培养及药敏、PCR-TB-DNA、X-pert及Hain等检测[4]。

(1)抗酸染色

①初染：用玻片夹，夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2～3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3～5分钟，待标本冷却后用水冲洗。②脱色：3%盐酸酒精脱色30秒～1分钟；用水冲洗。③复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。

(2)BD-960快速培养

标本接种前 ，在MGIT培养管中先加入 0.8mL MGIT PANTA /Growth Supplement(杂菌抑制剂 /生长添加剂)，再加入 0.5 mL处理后悬浊液，同时接种血平板(检测是否污染)、直接涂片抗酸染色(以便阳性快速报告)，将培养管放入 BD BACTECTMMGITTM960仪。培养法严格按照 BD BACTECTMMGITTM960 系统操作说明书进行，培养时间设定为42d。仪器提示阳性结果，取培养液涂片用快速抗酸染色法进行确认。抗酸染色阳性的菌株用荧光PCR 技术鉴定是结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌，操作严格按照试剂盒说明书进行。仪器提示阳性结果，涂片抗酸染色镜检未找到抗酸杆菌，将此分枝杆菌培养的标本接种在血平板、麦康凯平板、沙氏平板、真菌显色平板，经37 ℃培养，有革兰阴性杆菌或真菌生长，此情况为标本污染判为假阳性。所有接种和其他处理步骤都应在生物安全柜中进行，使用生物安全水平为 Ⅱ 级的接种方法、防护措施和设备。所有接种过的培养管等必须先经过高压灭菌后再按医疗垃圾处理。

(3)罗氏培养及药敏试验

采集冲洗液标本，采取酸性改良罗氏培养基进行培养，培养后再进行药敏试验。采取NaOH(3%)前处理，3倍体积处理液置于无菌痰杯，冲洗液充分液化，于20 min内接种两支罗氏培养基。再通过纯菌按高低两个药物浓度做药敏实验；采用绝对浓度间接法，并设对照管和对硝基苯甲酸(PNB)，α-羧酸肼噻吩(TCH)进行菌型鉴定；所用药敏浓度：异烟肼(H)分别为1和10μg/mL、利福平(R)分别为50和250μg/mL、链霉素(S)分别为20和200μg/mL、吡嗪酰胺(Z)分别为25和100μg/mL、乙胺丁醇(E)分别为5和50μg/mL、利福喷丁(RFT)为50和250μg/mL、对氨基水杨酸钠(P)分别为1和10μg/mL、氧氟沙星(OFLX)分别为5和50μg/mL、丁胺卡那(AK)分别为10和100μg/mL、丙硫异烟胺(TH)分别为25和100μg/mL、对氨基水杨酸异烟肼(PI)分别为1和10μg/mL、卷曲霉素(C)分别为100和1000μg/mL。菌液浓度为10-2取0.1mL接种培养基上，(35±1)℃培养四周报告。

(4)PCR-TB-DNA

取无菌灌洗冲洗瓶采集每位研究对象支气管肺泡冲洗液5 mL，密闭处理立即送检，通过荧光定量PCR法进行检测，标本内加入等体积NaOH(4%)混合摇匀，在室温条件下放置30 min，取液化后标本1 mL置于离心管内，离心处理(12 000r/min，5 min)，去除上清液，置入1mL无菌生理盐水，洗涤，离心处理(12000r/min，5 min)，放入核酸提取仪，通过最大转速震荡5 min，在95℃热水中热浴5 min，离心处理(5000 r/min，1 min)，取上清液，通过博奥生物集团有限公司结核分酸检测试剂盒操作执行。

三、结核杆菌培养

(1)X-pert

取痰液标本加入2 mL处理液内，置于涡旋振荡器上混合均匀孵育15 min，取处理液加入反应盒内，置于GeneX-pert检测模块内，2 h后判断检测结果。

(2)Hain检测

指导患者深吸气后用力咳出气管深处痰液置于培养瓶内，依据中国防痨协会基础专业委员会制定的《结核病诊断实验室检验规程》中相关标准对痰标本实施接种培养，将接种后痰标本消化液采取Geno Type MTBDRplus检测试剂盒(德国Hain MTBDRplus公司)进行检测。

四、观察指标

对比862例菌阴肺结核患者在不同方法下抗酸杆菌及结核分枝杆菌的相关检测情况(见表1)。

表1 862例患者不同方法分枝杆菌相关检测情况[n(%)]

五、统计学分析

采用SPSS20.0软件进行数据处理，计数资料用百分比表示，采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

两组患者不同方法抗酸杆菌及结核分枝杆菌相关检测情况，如(表2)所示：支气管镜检前后痰液及冲洗液标本抗酸染色阳性率分别为0.00 %(0/862)、6.15 % (53/862)及 12.18%(105/862)，三者之间有显著性差异(P<0.05)；冲洗液BD-960快速培养、罗氏培养及药敏、PCR-TB-DNA、X-pert及Hain检测阳性率分别为：25.17 %(217/862)、26.57%(229/862)、42.69%(368/862)、52.32%(451/862)及47.45%(409/862)，分别与镜检前传统痰涂片抗酸杆菌阳性率比较均有显著性差异(P<0.05)；支气管冲洗液抗酸染色联合BD-960快速培养、PCR-TB-DNA、X-pert、Hain及罗氏培养阳性率高达65.89%(568/862)，分别与镜检前后传统痰涂片抗酸杆菌阳性率比较均有显著性差异(P<0.05)。支气管冲洗液抗酸染色联合BD-960快速培养、罗氏培养阳性率为(33.76%，291/862)低于支气管冲洗液PCR-TB-DNA、X-pert、Hain阳性率(59.19%，509/862)。差异具有统计学意义。其中，451例冲洗液Xpert阳性的标本中，存在rpoB基因突变的有83例，突变率为18.40%；409例冲洗液Hain阳性的标本中，检测到异烟肼耐药的有79例，突变率为19.32%(见表3)。

表2 862例患者结核分枝杆菌病原学与分子生物学检测阳性率比较

表3 X-pert及Hain阳性患者基因突变情况[n(%)]

讨 论

结核病作为一种慢性传染疾病，严重的影响着人们的身体健康和生活质量水平，我国是结核病发病率较高国家之一[5]。早发现、早诊断、早治疗是控制结核病、阻断结核病传播的重要措施。有研究表明[6]，菌阴肺结核患者占所有肺结核患者的60%，如果痰菌阴性肺结核患者不能得到有效的治疗，会进一步发展成为痰菌阳性肺结核疾病，从而造成更多的人群患上肺结核疾病。以往临床上对该疾病的认识不全、检查手段的局限性，导致临床上大量漏诊、误诊的现象发生，因此如何有效的对结核患者进行疾病的确诊具有十分重要的临床意义[7]。

当前临床多通过痰涂片和痰培养诊断肺结核，具有操作简单等优势，但敏感性与特异性较低。而电子支气管镜检查不仅能够直观的观察气道黏膜情况，且能够通过对肺部病灶所在的支气管进行肺泡冲洗、支气管冲洗等检查，联合相关检测能提高肺结核的诊断率。其中肺泡冲洗可有效的增加对病灶的接触面，同时生理盐水的注入还会对支气管产生一定的刺激性，导致患者出现不同程度的咳嗽，可能会让深部结核杆菌被咳出得以回收，从而提高冲洗液相关检测的阳性率[8]。本研究，支气管镜检查前痰涂片抗酸染色阳性率为0%，通过支气管镜检查等刺激后，镜检后痰涂片抗酸染色阳性率明显升高，而支气管镜冲洗检查阳性率更高(12.18%)，冲洗与既往国内外相关研究结论相一致[9-10]。此外，通过肺泡冲洗液进行抗酸染色检查、PCR、X-pert、Hain等综合诊断，可将阳性率提高至65.89%，显著高于普通痰涂片检查(P<0.001)，提示支气管镜检查联合检测方式，可提高菌阴肺结核确诊率。本研究还发现，所有分子检测手段(PCR、X-pert、Hain)综合阳性率显著高于所有病原学检测综合(抗酸染色、快培、罗培)。同时结合X-pert及Hain检测阳性患者中突变的检出情况，显示分子检测手段在结核病的诊断甚至治疗中，起到了更加重要的作用，因此应重视分子检测手段在结核病特别是菌阴肺结核中的应用价值，应积极加以推广。

菌阴肺结核诊断率不高的因素有很多，其中不仅与肺结核患者的病变类型，如血行播散型肺结核等，还与痰标本留取、运输，甚至检测人员的技术等，甚至与肺结核不同检测技术本身的局限性等均有关。通过将上述不同因素进行完善改进，同时利用本研究中支气管镜诊断技术同时联合多种不同检测方式，可明显提高菌阴肺结核患者的诊断率。因此支气管镜技术应在肺结核特别是菌阴肺结核的临床诊疗过程中积极推广。

综上所述，采用电子支气管镜肺泡冲洗检查联合抗酸染色，联合BD-960快速培养、PCR-TB-DNA、X-pert、Hain及罗氏培养检测能够明显提升菌阴肺结核患者的阳性检出率，对提高菌阴肺结核诊断具有十分重要的临床应用价值。