基于网络药理学探讨炙甘草汤治疗心律失常的作用机制

叶嘉豪　胡志希　钟森杰　邱宏　熊霞军

摘要 目的：運用网络药理学方法探讨炙甘草汤治疗心律失常的作用机制。方法：运用中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP）和BATMAN-TCM数据库，筛选出炙甘草汤有效成分及其作用靶点。通过GeneCards、OMIM数据库筛选出心律失常的疾病靶点，并与中药靶点合并取交叉靶点，采用String数据库构建靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并运用Cytoscape 3.7.2筛选关键基因，同时借助CytoNCA插件进行拓扑分析;运用Bioconductor数据库及RX64 4.0.0软件对交集基因进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。利用swissdock在线分子对接工具对蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中的核心蛋白与核心化合物分子进行分子对接。结果：筛选出171个化合物及4 090个靶点，得到关于心律失常疾病靶点435个;PPI结果显示，Degree值排名前6的基因分别为：INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1、TNNI3;拓扑分析显示Degree排名前5的基因分别为：EGFR、HSPA8、NTRK1、ESR1、HSP90AA1;分子对接结果显示：炙甘草汤的大多数活性成分和关键靶点的结合率较强，其结合能最低为SCN5A与Lysine、KCNH2与Gamma-Aminobutyric Acid;GO富集分析显示炙甘草汤治疗心律失常与心脏收缩、心脏肌肉收缩、心的过程、横纹肌收缩、心脏收缩调节等有关。KEGG富集分析显示心肌细胞的肾上腺素能信号、肥厚型心肌病、cGMP-PKG信号通路、扩张型心肌病相关。结论：炙甘草汤治疗心律失常具有多成分、多靶点、多途径的特点。

关键词 心律失常;炙甘草汤;网络药理学;靶点;通路;分子对接;作用机制

Mechanism of Zhigancao Decoction in Treatment of Arrhythmia Based on Network Pharmacology

YE Jiahao，HU Zhixi，ZHONG Senjie，QIU Hong，XIONG Xiajun

（Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Zhigancao Decoction in treating arrhythmia based on network pharmacology.Methods：The active ingredients and targets of Zhigancao Decoction were screened out from Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and BATMAN-TCM，and the disease targets of arrhythmia were screened out through GeneCards and OMIM.The common targets of the drug and the disease were obtained.String was used to construct a protein-protein interaction（PPI） network of targets，and Cytoscape 3.7.2 was used to screen key genes，which underwent topological data analysis by CytoNCA plug-in.Bioconductor and RX64 4.0.0 were adopted for GO enrichment and KEGG pathway enrichment analyses of common genes.The core proteins were subjected to molecular docking with core compound molecules in the PPI network using SwissDock.Results：A total of 171 compounds and 4 090 targets were screened out，and 435 targets related to arrhythmia were obtained.PPI results showed that in terms of degree，the top 6 genes were INS，KCNH2，SCN5A，CAV3，GJA1，and TNNI3.Topological data analysis revealed that in terms of degree，the top 5 genes were EGFR，HSPA8，NTRK1，ESR1，and HSP90AA1.Molecular docking results showed that most of the active ingredients and key targets of Zhigancao Decoction had high binding rates，with the lowest binding energy of SCN5A to lysine and KCNH2 to γ-aminobutyric acid.GO enrichment analysis showed that the therapeutic effect of Zhigancao Decoction was related to heart contraction，heart muscle contraction，heart process，striated muscle contraction，and heart contraction regulation.KEGG enrichment analysis showed that the therapeutic effect of Zhigancao Decoction was associated with adrenergic signal in cardiomyocytes，hypertrophic cardiomyopathy，cGMP-PKG signaling pathway，and dilated cardiomyopathy.Conclusion：Zhigancao Decoction is characterized by multi-component，multi-target，and multi-pathway in the treatment of arrhythmia.

Keywords Arhythmia; Zhigancao Decoction; Network pharmacology; Target; Pathway; Molecular docking; Mechanism

中图分类号：R289.5;R541文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.002

心律失常是由于各类心脏疾病所导致心律传导异常的病变，具体表现为心律过速或心律不齐、心房颤动以及相关病变引发的全身性症状[1]。患者常因心律失常出现乏力、头晕等症状;严重者会出现抽搐、晕厥、胸痛或气促等现象，甚至会引起心源性猝死[2]。临床上常用炙甘草汤治疗心律失常，炙甘草汤出自《伤寒论》，具有益气滋阴，通阳复脉之功效[3-4]。主治阴血阳气虚弱，心脉失养证。脉结代，心动悸，虚羸少气，舌光少苔，或质干而瘦小者;虚劳肺痿等。其由炙甘草、生姜、桂枝、人参、地黄、阿胶、麦冬、火麻仁、大枣组成。现代研究表明，炙甘草汤具有效扩张血管，从而促进患者血液循环，改善心肌供血，同时能有效加强心脏收缩力的作用[5-7]。现基于网络药理学及分子对接技术，探讨炙甘草汤治疗心律失常的分子作用机制，为临床实验提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 炙甘草汤化学成分筛选及潜在靶点靶点预测 运用中药系统药理数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）查找关于炙甘草汤的主要有效成分及靶点，筛选条件为口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）>30%及类药性（Drug Likeness，DL）>0.18，检索关键词为：甘草、生姜、桂枝、麦冬、地黄、火麻仁、阿胶、大枣、人参;若在TCMSP中找不到相关中药，则利用Batman-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php）查找有效成分及相关靶点，筛选条件为SCORE>20。

1.2 心律失常疾病靶基因的筛选 检索GeneCard数据库（https：//www.genecards.org/）、OMIM数据库（https：//omim.org/）筛选心律失常相关靶点，以“arrhythmia”为关键词，Genecard选取相关性得分>10的靶点，通过合并去重后，最终获得心律失常基因靶点。

1.3 构建“中药-活性成分-疾病”交集靶基因数据库及其网络图 将炙甘草汤潜在靶点与心律失常靶点利用PERL软件进行合并，剔除重复或无对应化学成分的靶点后，获得炙甘草汤-心律失常共同靶点，利用Cytoscape 3.7.2（http：//www.cytoscape.org/）对其进行可视化，构建出“中药-活性成分-疾病”基因网络图。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用網络及拓扑分析 将炙甘草汤-心律失常共同靶点导入String数据库（https：//string-db.org/），种族选择Homo sapiens，其置信度设置为0.4，进行靶点蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI），按照节点连接度（Degree）高低对靶点进行前后排序。利用Cytoscape 3.7.2软件中的CytoNCA工具对靶点进行拓扑分析，按照节点度值（Degree）和中介中心度（Betweenness Centrality）的数值高低进行排序，在构建关键节点的子网络上以Degree和Betweenness≥中位数为筛选条件，筛选核心靶基因。

1.5 富集分析 利用Bioconductor数据库及RX64 4.0.0软件对核心靶基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，物种选择为人，阈值设定为P≤0.5，GO富集分析选择生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）。

1.6 分子对接 从PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）下载PPI网络中得分排名前4的蛋白结构，利用Pymol软件移除配体和水分子;从PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中下载核心化合物的sdf文件，利用OpenBabel软件将其转化为mol2格式，将靶点蛋白及化合物分子运用swissdock（http：//www.swissdock.ch/）进行在线分子对接。配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生作用的可能性越大。当结合能绝对值>4.25表示分子与靶点具有一定的结合能力，>5.0表示结合能力较强，>7.0表示结合能力很强[8]。

2 结果

2.1 炙甘草汤活性成分筛选及靶点预测 根据筛选标准，共得出171个化合物，其中大枣16个、桂枝7个、火麻仁6个、人参22个、生姜5个、甘草92个，阿胶3个、地黄2个、麦冬18个，各中药有效成分见表1。检索出靶点为4 090个，其中大枣113个、甘草2 506个、桂枝73个、火麻仁139个、人参256个、生姜75个、阿胶418个，地黄205个，麦冬305个。

2.2 心律失常相关靶点 利用GeneCards、OMIM数据库，以“arrhythmia”为关键词，Genecard筛选标准为相关度Score>10，共获得疾病靶基因435个，其中Genecard获得257个，OMIM获得178个。

2.3 “中药-成分-疾病”网络的构建 将炙甘草汤靶点与心律失常靶点导入Excel表进行对比分析，发现心律失常与炙甘草汤潜在靶点有44个重合。将结果导入Cytoscape软件构建“中药-成分-疾病”可视化网络。靶点节点44个，化合物节点105个，共计149个，620条边;化合物中度值前5为：Stigmasterol、Lysine、Gamma-Aminobutyric Acid、Fumarine、Licoagrocarpin;中药-成分-靶基因网络见图1。

2.4 中药-靶点相互作用网络构建 将炙甘草汤-心律失常共同靶点导入string中。限定物种为人，设置置信度阈值≥0.4，隐藏网络中不相关联的节点。结果共涉及44个节点，198条边，平均节度点为9.0，平均局部聚类系数为0.619。见图2。采用RX64 4.0.0描绘出前30个靶基因的柱状图，并进行柱状图可视化。得到Degree排名前6为INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1、TNNI3。见图3。

2.5 拓扑分析 将从string数据库中得到的疾病与化合物交集基因PPI网络图导入Cytoscape，运用Cytoscape中的CytoNCA插件对其进行网络拓扑分析，筛选条件为节点连接度（Degree）和节点介度

2.6 GO及KEGG通路富集分析 利用Bioconductor数据库及RX64 4.0.0软件对炙甘草汤作用的靶基因进行生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）的GO、KEGG通路富集分析，设定阈值为P≤0.05。

GO富集分析结果显示：得到条目共728个，其中BP条目612条，CC条目48条，MF条目68条。BP主要与心脏收缩（Heart Contraction）、心脏肌肉收缩（Cardiac Muscle Contraction）、心的过程（Heart Process）、横纹肌收缩（Striated Muscle Contraction）、心脏收缩调节（Regulation of Heart contraction）相关。CC主要与阳离子复杂通道（Cation Channel Complex）、收缩纤维（Contractile Fiber）、肌节（Sarcomere）、收缩纤维部分（Contractile Fiber Part）、肌原纤维（Myofibril）等通路相关。MF与电压门控离子通道活性（Voltage-gated Ion Channel Activity）、电压门控通道活动（Voltage-gated Channel Activity）、离子通道绑定（Ion Channel Binding）、频道活动（Channel Activity）、被动跨膜转运蛋白活性（Passive Transmembrane Transporter Activity）相关。

炙甘草汤治疗心律失常主要富集的KEGG生物学通路有44条，其与心肌细胞的肾上腺素能信号（Adrenergic Signaling in Cardiomyocytes）、肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy）、cGMP-PKG信号通路（cGMP-PKG Signaling Pathway）、扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy）等疾病相关。

对其结果进行可视化处理。见表2和图7。条形图X轴长度代表富集的基因数目，Y轴代表名称，条形图颜色代表富集程度;气泡图颜色代表富集程度，即P值大小;气泡大小代表富集的基因數目。

2.7 分子对接 从PDB数据库下载INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1的蛋白结构，运用Pymol软件移除配体和水分子，由于数据库中没有搜索到CAV3，故未做分析;从PubChem数据库中下载Fumarine、Gamma-Aminobutyric Acid、Licoagrocarpin、Lysine、Stigmasterin的小分子结构sdf文件，利用OpenBabel软件将其转化为mol2格式，将靶点蛋白及化合物分子运用swissdock进行在线分子对接。

结果显示：对接得分均≤-5.0 kcal/mol（1 cal=4.184 J），炙甘草汤与预测的作用靶点有较好的结合，其结合能绝对值前2名分别为：SCN5A与Lysine、KCNH2与Gamma-Aminobutyric Acid，其结合能绝对值均大于8，说明其拥有较强的结合能力。分子对接分数见表3，分子对接见图8～9。

3 讨论

本研究基于网络药理学，筛选出炙甘草汤有效活性成分及靶点，系统研究了炙甘草汤对心律失常的干预作用及作用机制。通过PPI网络分析，发现INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1、TNNI3。SCN5A与心肌动作电位的形成相关，其为心脏钠离子通道同型异构体Nav1.5通道蛋白的基因，该基因与长QT综合征、病态窦房结综合征等发病相关[9-11]。CAV3具有调控心血管病发生发展的作用，如在胆固醇循环中，CAV能使胆固醇由包膜向内涵体转运，从而起到抑制冠脉粥样硬化的作用[12];当CAV3高表达时，会破坏心肌的结构与功能，从而引起心肌纤维化。KCNH2对平滑肌细胞兴奋性调节具有重要作用，其突变可能会导致钾离子流外流，动作电位时程和不应期不均一性缩短，形成短QT间期和增加易损性[13-14]。TNNI3基因编码cTnI蛋白，而cTnI是组成肌钙蛋白的成分之一，是心肌组织收缩的调节蛋白，研究表明，TNNI3在心力衰竭、心肌肥大、缺血再灌注及心脏电传导中发挥一定作用[15-16]。

通过拓扑分析，发现EGFR、HSPA8、NTRK1、ESR1、HSP90AA1。表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）是一种受体型蛋白酪氨酸激酶，当其被激活时，其胞内酪氨酸激酶功能域发挥活性，通过复杂的生化级联反应及信号传递，参与了体内许多重要的细胞生物过程如生长、分化、凋亡、黏附、迁移等[17]。研究显示，EGFR激酶可能通过心肌例子通道的酪氨酸磷酸化参与心脏电生理的调控。雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）与雌激素结合，其结合物具有调节两类活性物质的生成和释放的功能，如舒张血管物质：内皮依赖性舒张因子、依前列醇等;缩血管物质：内皮素、血管紧张素等;起到改善血管内皮功能，抑制炎症、抗动脉粥样硬化等作用[18]。热激蛋白（Heat Shock Protein，HSP）是在应激情况下合成的蛋白。在保护心肺组织及中枢神经系统等免受内外源性损伤中发挥巨大作用，并对炎症反应、肿瘤、自身免疫过程等具有重要的调控作用[19]。

分析对接结果显示，INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1与炙甘草汤的物种核心化合物的对接能量均小于-5 kcal/mol，说明炙甘草汤的活性化学成分可以和INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1蛋白较稳定地结合。对接能量最低为SCN5A与赖氨酸;KCNH2与γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric Acid，GABA）;说明炙甘草汤活性物质可能与以上3种蛋白结合，在治疗心律失常上发挥主要作用。

通过GO富集分析预测炙甘草汤对心律失常作用机制可能是与心脏收缩、心脏肌肉收缩、心的过程、横纹肌收缩、心脏收缩调节、阳离子复杂通道、收缩纤维、肌节、收缩纤维部分、肌原纤维、电压门控离子通道活性、电压门控通道活动、离子通道绑定、频道活动、被动跨膜转运蛋白活性等有关。通过KEGG分析预测出炙甘草汤治疗心律失常可能与心肌细胞的肾上腺素能信号、肥厚型心肌病、cGMP-PKG信号通路、扩张型心肌病等有关。本研究说明炙甘草汤是通过多靶点、多通路来治疗心律失常，通过研究其靶点及信号通路，今后可为开展动物或人体实验进行验证提供理论依据。

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（2020-10-27收稿 本文编辑：张雄杰）

基金项目：国家自然科学基金项目（81774208）;湖南省教育厅创新平台开放基金重点项目（2017K070）

作者简介：叶嘉豪（1996.08—），男，硕士研究生在读，研究方向：心血管疾病证本质与诊治规律，E-mail：1062940906@qq.com

通信作者：胡志希（1962.12—），男，博士，教授，博士研究生导师，研究方向：心血管疾病证本质与诊治规律，E-mail：515800272@qq.com