抗猪繁殖与呼吸障碍综合征中药单体成分的体外筛选

张淼丹，布玮玮，张春杰

（1.洛阳职业技术学院，河南洛阳 471000；2.南召县纪委监委，河南南阳 474650；3.河南科技大学，河南洛阳 471000）

猪繁殖与呼吸障碍综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）俗称猪蓝耳病，是由PRRSV病毒引起的以母猪出现繁殖障碍，仔猪出现严重呼吸道症状的传染病。该病以急性、高热性和致死率高为特征，严重影响我国养猪业的发展。

此疾病主要症状是母猪免疫力下降，进而使机体出现一些病原微生物的继发感染，死亡率增加，目前尚无有效治疗药物。由于商业疫苗只能提供部分保护，接种灭活疫苗后，抗体产生的速度慢且滴度低，对机体产生的保护力度不够（Nilubol等，2004），弱毒疫苗虽免疫效果较好，但本身仍有毒性，存在一定的危险性（毋安雄等，2003；Meng等，1995）。因此，提高机体免疫力是抗 PRRSV 感染的关键（Botner等，1999）。中国中药资源丰富，有的药材具有免疫调节和抗病毒作用（张红英等，2010），中药提取物在治疗动物病毒感染性疾病方面具有独特的优势（Todorov等，2014；Sabde 等，2011；Tan 和 Vanitha，2004；Shan等，1999）。本试验按照前期试验结果拟选取4种较理想的抗病毒中药单体进行体外抗PRRSV作用的研究，以期获得有较好抗PRRSV效果的中药单体及其有效浓度。

1 材料与方法

1.1 细胞和病毒 猴肾上皮样细胞（Marc145），PRRSV标准毒（SD-16），均由河南科技大学动物疫病与公共卫生实验室保存。

1.2 试剂 奎宁酸、绿原酸、连翘苷、黄芩苷中药单体，HPLC≥98%，购买于西安飞达生物有限公司；胰酶，DMEM培养基，DMSO，购自碧云天生物工程公司。

1.3 体外培养 参照布玮玮（2014）的方法进行细胞体外培养试验。根据试验设计进行观察，记录每次观察到的细胞形态。中药单体的安全浓度范围已由课题组确定。详细中药单体安全范围见布玮玮（2014）的研究。

1.4 有效中药单体体外抗病毒试验

1.4.1 有效中药单体对PRRSV阻断作用的测定在安全浓度范围内将各有效中药单体稀释6个浓度待用。观察96孔板内培养的Marc-145细胞，待孔底铺满单层细胞，弃去培养基，按100 μl/孔加入稀释单体，试验设置每个稀释度分别重复4孔。37℃作用4 h，弃上清，加100 μl/孔的100 TCID50PRRSV，分别设8孔的细胞和病毒作为对照组，培养箱37℃ 5% CO2进行培养，每天需观察细胞病变（CPE）。待病毒对照组CPE达到75%以上时记录各孔CPE情况。继续培养至120 h，用酶标仪570 nm/630 nm双波长模式测各孔内细胞OD值。

1.4.2 有效中药单体对PRRSV抑制作用的测定 观察96孔板内培养的Marc-145细胞，待孔底铺满单层细胞，弃上清，按100 μl/孔加入100 TCID50的 PRRSV，37℃ 5% CO2培 养 箱 培养2 h。弃去毒液，100 μl/孔加入稀释好的药物，试验设置每个稀释度分别4孔重复操作，另外设置8孔的空白细胞和病毒作为对照组，培养箱37℃ 5% CO2进行培养，每天需观察细胞病变（CPE）。待病毒对照组CPE达到75%以上时记录各孔CPE情况。继续培养至120 h，用酶标仪570 nm/630 nm双波长模式测各孔内细胞OD值。

1.4.3 有效中药单体对PRRSV直接杀灭作用的测定 将100 TCID50病毒液与各浓度的单体混合，4℃作用4 h，然后将混合液分别加到长成单层的Marc-145细胞的96孔板中，100 μl/孔，试验设置每个稀释度分别4孔重复操作，另外设置8孔的空白细胞和病毒对照，培养箱37℃ 5% CO2进行培养，及时观察病毒对照组细胞病变效应（CPE），达到75%以上时记录各孔CPE情况。继续培养至120 h，用酶标仪570 nm/630 nm双波长模式测各孔内细胞OD值。

1.5 CPE结果判定标准与方法 细胞病变效应（CPE）效果判定标准主要观察以下指标：培养液颜色是否变暗；观察Marc-145细胞表面是否附着PRRSV；Marc-145细胞细胞集堆、萎缩、脱落甚至裂解。观察细胞，记录CPE情况。“-”表示为正常细胞，“+”表示出现CPE的细胞有25%，“++”表示出现CPE的细胞有25%～50%，“+++”表示出现CPE的细胞有50%～75%，“++++”表示出现CPE的细胞有75%～100%。

1.6 MTT法判断方法 细胞培养到120 h弃上清，用预热37℃的PBS漂洗2次；在培养板中加20 μl/孔的 MTT（5 mg/mL），37℃培养 4 h后 ；在培养板中每孔加130 μl二甲基亚砜，置于振荡器上轻微振荡10 min，将细胞中的紫色结晶充分溶解；酶标仪用570 nm/630 nm双波长模式测定每孔的OD值，以敏感波长与非敏感波长OD值之差作为中药单体抗PRRSV感染细胞的指标，OD值越大，抗PRRSV作用效果越好。药物保护率的计算方法如下：

药物对细胞的保护率/%=（加药孔OD值-病毒对照孔OD值）/（细胞对照孔OD值-病毒对照孔OD值）×100。

2 结果

2.1 有效中药单体体外抗病毒的结果

2.1.1 中药单体阻断病毒吸附的检测结果 每天按时观察Marc-145细胞CPE情况，及时观察病毒对照组的细胞病变效应，如果CPE达到75%以上，继续培养至120 h，用MTT法，570 nm/630 nm双波长模式测细胞OD值。依据所得OD值计算各中药浓度对细胞的保护率，如图1。较高浓度的4种中药单体对细胞的保护率均能达到50%左右。4种药物单体的6个浓度见表1。

表1 不同中药单体体外抗PRRSV活性的浓度

图1 对Marc-145细胞的保护率（先加药再接毒）

2.1.2 中药单体抑制病毒复制的检测结果 每天按时观察Marc-145细胞CPE情况，及时观察病毒对照组的细胞病变效应，如果CPE达到75%以上继续培养至120 h，用MTT法，570 nm/630 nm双波长模式测细胞OD值。依据所得OD值计算各中药浓度对细胞的保护率。见图2。

由图2可知，奎宁酸和黄芩苷的保护率较低，绿原酸和连翘苷相对较好，保护率能达到50%以上。100 μmol的连翘苷对细胞的保护率达90%，100 μmol的绿原酸也能达到较好的保护作用。且数据显示，绿原酸和连翘苷虽均有高的保护率，但安全范围内各浓度间的数据差异比较显著，说明其保护作用均不稳定。

图2 对Marc-145细胞的保护率（先接毒再加药）

2.1.3 中药单体直接杀灭病毒的检测结果每天按时观察Marc-145细胞CPE情况，及时观察病毒对照组的细胞病变效应，如果CPE达到75%以上继续再培养至120 h，用MTT法，570 nm/630 nm双波长模式测细胞OD值。根据所得OD值计算各中药浓度对细胞的保护率，如图3。

由图3可知，黄芩苷对PRRSV基本上没有杀灭作用；连翘苷在100 μM时保护率在80%，但随着浓度变化，其保护作用变化很大；奎宁酸和绿原酸均有明显的保护作用，且随浓度变化趋势缓慢。

图3 对Marc-145细胞的保护率（药物与病毒作用）

综合对病毒的阻断作用、抑制作用和杀灭作用3种结果，4种中药单体均有较好的抗PRRSV活性，并呈一定的量效关系。4种中药单体均能有效阻断病毒吸附；绿原酸和连翘苷能有效抑制病毒复制，且连翘苷在100 μmol时保护率最高；绿原酸和奎宁酸对PRRSV直接杀灭作用较为明显，连翘苷在100 μmol也有明显的保护作用。

3 讨论

近年来，中药对动物疾病的治疗研究已成热点，传统中药对动物具有毒性小、安全性高、副作用小、不容易产生抗药性和依赖性等优点，受到养殖户的青睐，因此，本文采用4种中药单体来探索其对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的治疗效果。研究发现，当中药物浓度高于某一值时，会对细胞产生毒性，当中药单体稀释液作用于Marc-145细胞后，浓度过高会导致细胞出现CPE现象，开始坏死、脱落，最终溶解；但当药物浓度持续降低时，细胞病变效应CPE会下降，说明药物对细胞的毒性也随之下降；当药物浓度持续下降到某点时，细胞病变效应基本消失，这也说明，天然药物毒性与其浓度呈正相关，与国内外其他研究者的观点一致（秦书敏等，2017；秦华珍等，2009）。

本研究采用CPE法和MTT法同时来确定药物的抗病毒活性。本试验采用体外细胞培养技术，设计了3种给药方式探讨中药单体的抗病毒作用机理。第一，先加药入细胞再接毒，观察药物能否阻断病毒的吸附和进入；第二，先接毒于细胞再加药，目的为了观察药物是否对细胞内的病毒复制起到抑制效果；最后，采用中药和病毒先自行作用数段时间后，再加入细胞，目的是为了观察药物是否对病毒有直接杀灭作用。

通过CPE法观测和MTT法测得的OD值，本研究选用的奎宁酸、绿原酸、黄芩苷和连翘苷4种最为有效的抗病毒中药单体对PRRSV均有很好的阻断吸附效果，保护率都能达到50%以上（布玮玮，2014）；综合对病毒的阻断作用、抑制作用和杀灭作用3种结果，4种中药单体均有较好的抗PRRSV活性，能给细胞提供较好的保护作用，初步探索到了最佳有效浓度，为PRRS的治疗药物开发提供了理论数据，也为研究中药抗病毒作用机理提供了新的探索途径。本试验采用体外培养法测定中药物对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的抑制效果。在当今畜牧业养殖过程中，我们应合理用药，综合考虑个体、环境及出现的众多因素，从而选择出最佳的临床用药剂量。在实践中如何应用有效药物治疗猪繁殖与呼吸障碍综合征还需进一步探讨。

4 结论

4种中药单体对PRRSV均有很好的阻断吸附效果，保护率均在50%以上，其中绿原酸和连翘苷的抗病毒复制活性也很明显，都在100 μM时能达到最好的抗病毒效果；奎宁酸、绿原酸和连翘苷对病毒还具有较好的直接杀灭效果。综合3种情况，奎宁酸、绿原酸和黄芩苷、连翘苷均有抗PRRSV活性，尤其是绿原酸和连翘苷能给细胞提供较好的保护作用。