两种硝化抑制剂对黄瓜种子萌发的影响

刘昌森，周 欢，周辰炎，范良苗，唐 凡，胡欣朦，王佩玉，杨文杰

（江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心/淮阴师范学院，江苏淮安 223300）

黄瓜作为一种广受欢迎的蔬菜，其口感佳、维生素含量高，一直以来市场需求量都很大[1]。黄瓜在我国各地广泛种植，在许多地区采用的是温室或塑料大棚栽培方式。据了解，目前市售黄瓜大多在栽种时，施加氮肥的同时也添加了硝化抑制剂，一方面可以增加作物产量，降低硝酸盐含量，提高作物品质；另一方面也可以抑制土壤细菌硝化作用，减少氮肥损失，提高环境效益。采用这种生产方法，不仅对消费者健康有益，提高种植户收入，还可以减轻环境压力，有利于生态建设。

双氰胺（DCD）和3,4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）是农业生产上常用的两种硝化抑制剂[2-3]，其在增加农作物产量、提高农作物品质和改善土壤生态等方面的作用，国内外学者已开展了大量研究，取得了很多成果。伍少福等[4]在大田种植中，施用添加了DMPP 的复合肥，对黄瓜、西瓜产量及营养品质有很大提高，且对不同西瓜品种的作用效果不同。温室栽培黄瓜时，赵欧亚等[5]在农民习惯施肥量基础上，添加了氮肥用量20%的DCD，其黄瓜品质和产量均得到显著提高；另外，张琳等[6]种植时配施含DCD 的氮肥，发现可明显减少温室气体N2O 排放量，氮素流失减少，氮肥在土壤中留存时间延长；赵婉伊等[7]将硝化抑制剂与脲酶抑制剂配合使用，发现黄瓜生长过程中，除产量提升外，氮素可以缓慢释放，矿物质利用率也得到提高。同时也有学者研究发现，当硝化抑制剂的施用浓度过高时，会对作物幼苗产生种种危害[8-10]。

上述研究中，硝化抑制剂作为添加剂直接使用，是否会产生负面影响仍不明确，因此明确硝化抑制剂的安全添加量是当前需要解决的问题。在适宜环境下，黄瓜种子吸涨水分后便开始萌发，萌发过程中内部各种酶活力的动态变化，可间接反映种子发芽的长势。种子萌发过程，这一系列相关酶活力变化，是植物整个生命活动周期里最为强烈的一个阶段[11]，可以反映出硝化抑制剂对植物生长发育的影响。本试验采用培养皿发芽法，研究DCD、DMPP 对黄瓜种子发芽率、淀粉酶、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量的影响，以了解其对黄瓜种子发芽的影响，为明确设施黄瓜栽培中DCD、DMPP 的合理使用量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄瓜种子（津研4 号，购自淮安市农科院）；3,4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）、双氰胺（DCD），均为国药分析纯。

1.2 试验设计

选取饱满无虫害的黄瓜种子，经1%次氯酸钠溶液浸泡消毒30 min，充分洗净后浸种4 h，然后转入铺有滤纸的培养皿中，上覆双层纱布，保持湿度，置于人工气候箱中28 ℃条件下培养发芽。

设置DCD、DMPP 两个试验组，分别设置5 个处理，其中DCD 试验组设置T1 （1 μmol·mL-1）、T2（3 μmol·mL-1）、T3（5 μmol·mL-1）、T4（7 μmol·mL-1）、T5（10 μmol·mL-1）5个浓度处理；DMPP试验组设置T1（0.1μmol·mL-1）、T2（0.3μmol·mL-1）、T3（0.5μmol·mL-1）、T4（0.7 μmol·mL-1）、T5（1 μmol·mL-1）5 个浓度处理；试验组黄瓜种子第一天喷施不同浓度梯度的硝化抑制剂溶液，之后每天在固定时间喷施等量的去离子水；两试验组均以喷施去离子水的黄瓜种子为对照（CK）；试验各处理均设3 次重复。分别统计第3 天和第6 天各处理组黄瓜种子的发芽数量，并计算发芽势及发芽率。

黄瓜种子的发芽势、发芽率计算公式为：

种子发芽势=（第3天发芽数/总数）×100%；

种子发芽率=（第6天发芽数/总数）×100%。

1.3 测定项目

在种子发芽率试验基础上，分别筛选确定两个试验组中的3 个处理，进一步检测不同浓度的DCD 和DMPP 处理条件下黄瓜种子的淀粉酶活性、抗氧化酶活性及MDA 含量等生理指标，每处理设3 个重复。分别采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定淀粉酶活性[12]，紫外吸收法测定CAT 活性[13]，氮蓝四唑染色法测定SOD 活性[14]，愈创木酚法测定POD 活性[12]，硫代巴比妥酸法测定MDA含量[15]。

2 结果与分析

2.1 对黄瓜种子发芽率的影响

由表1 可知，DCD 试验组中，与CK 相比，T1、T2 处理的黄瓜种子发芽势和发芽率与其差异不明显，而T3、T4、T5 处理的黄瓜种子发芽势和发芽率均显著下降（P＜0.05），T5 处理组黄瓜种子的发芽势和发芽率分别降低至84.67%和93.67%，显著低于CK 和其他处理。DMPP 试验组呈现出与DCD 试验组相似的结果，即在T1、T2处理条件下，黄瓜种子的发芽势、发芽率与CK 差异不显著，而随着DMPP 处理浓度的增高，黄瓜种子的发芽势、发芽率显著降低（P＜0.05），T5 处理条件下黄瓜种子的发芽势、发芽率达到最低值，分别为81.67%、83.00%。由此可见，在一定范围内，低浓度DCD 溶液、DMPP 溶液对黄瓜种子发芽无明显抑制作用，而高浓度的DCD 溶液、DMPP 溶液则会抑制黄瓜种子发芽，显著降低种子发芽率。

表1 DCD、DMPP对黄瓜种子发芽的影响

2.2 对黄瓜种子淀粉酶活性的影响

由表2可知，在DCD试验组中，CK、T1、T3、T5处理之间的差异显著（P＜0.05），其中T1 处理的黄瓜种子淀粉酶显著高于CK，达到798.85 U·g-1，并随着DCD 处理浓度的增加，黄瓜种子的淀粉酶活性均有所降低，当DCD溶液浓度为10 μmol·mL-1时，种子淀粉酶活性降至最低，为530.26 U·g-1。而在DMPP 试验组中，T1、T3处理的黄瓜种子淀粉酶活性与对照组差异不显著，T5处理的黄瓜种子淀粉酶活性为738.73 U·g-1，显著低于CK（P＜0.05）。综合分析，低浓度的DCD提高了黄瓜种子萌发时的淀粉酶活性，高浓度的DCD 则会抑制其活性；DMPP处理下，表现出低浓度的DMPP对淀粉酶活性无显著影响，而高浓度DMPP则会抑制其活性。

表2 DCD、DMPP对黄瓜种子淀粉酶活性的影响 单位：U·g-1

2.3 对黄瓜种子CAT活性的影响

如表3 所示，DCD 试验组中，T1、T3 处理黄瓜种子的CAT 活性明显增加，极显著高于CK（P＜0.01），当DCD 溶液浓度为1 μmol·mL-1时，黄瓜种子的CAT活性最高，为357.49 U·g-1；而在10 μmol·mL-1DCD溶液的处理条件下，黄瓜种子的CAT 活性则降低至192.83 U·g-1，显著低于CK（P＜0.01）。DMPP 试验组中，CK 和T1 处理之间的CAT 活性差异不显著，但T3、T5 处理的CAT 活性则极显著低于CK（P＜0.01），随着DMPP 浓度升高，CAT 活性呈现明显下降趋势，当DMPP浓度为1 μmol·mL-1时，其CAT活性最低，为136.14 U·g-1。以上结果表明，低浓度的DCD 可以增加种子萌发时的CAT 活性，而低浓度的DMPP 对黄瓜种子的CAT 活性无明显影响；但随着DCD、DMPP 处理浓度的升高，黄瓜种子的CAT 活性则会受到一定程度的抑制。

表3 DCD、DMPP对黄瓜种子CAT活性的影响 单位：U·g-1

2.4 对黄瓜种子POD活性的影响

由表4 可见，DCD 溶液处理条件下，黄瓜种子的POD 活性呈现先升后降的趋势，各处理之间差异达到1%极显著水平；T1 处理的黄瓜种子POD 活性最高，为78.24 U·g-1，T3、T5 处理黄瓜种子的POD 活性均有所下降，极显著低于CK（P＜0.01）；当DCD 浓度为10 μmol·mL-1时，种子的POD 活性降至最低，为43.26 U·g-1。在DMPP 处理条件下，T1处理的种子POD 活性与CK 差异不显著，但T3、T5 处理的POD 活性呈现明显下降趋势，其中T5处理（1 μmol·mL-1）的POD活性降至52.00 U·g-1，极显著低于CK（P＜0.01）。

表4 DCD、DMPP对黄瓜种子POD活性的影响 单位：U·g-1

2.5 对黄瓜种子SOD活性的影响

由表5 可知，在DCD、DMPP 处理条件下，黄瓜种子的SOD 活性均呈现出先升后降的趋势。DCD 试验组中，T1 处理的黄瓜种子SOD 活性极显著高于CK（P＜0.01），T3、T5 处理的SOD 活性极显著低于CK（P＜0.01），随浓度升高呈明显下降趋势，当DCD 浓度 为10 μmol·mL-1时，种子的SOD活性最低，为19.41 U·g-1。DMPP 试验组中，T1处理黄瓜种子的SOD活性与CK差异不显著，而T3、T5处理与CK之间的SOD 活性差异达到1%极显著水平，其中T3 处理的黄瓜种子SOD 活性最高，为95.89 U·g-1，T5 处理的黄瓜种子SOD活性显著降低至70.58 U·g-1。

表5 DCD、DMPP对黄瓜种子SOD活性的影响 单位：U·g-1

2.6 对黄瓜种子MDA含量的影响

试验结果显示，DCD 试验组和DMPP 试验组中，黄瓜种子的MDA 含量呈现相同的变化趋势（见表6）。即CK、T1、T2 这3 个处理组之间的黄瓜种子MDA 含量差异不显著，但T3 处理的黄瓜种子MDA 含量极显著高于其他处理（P＜0.01）。综合分析，试验设置的浓度范围内，高浓度的DCD 或DMPP 可能会导致黄瓜种子的细胞结构损伤，而低浓度的DCD 或DMPP 处理，则无明显影响。

表6 DCD、DMPP对黄瓜种子MDA含量的影响单位：μmol·g-1

3 结论与讨论

试验结果表明，DCD、DMPP 处理浓度较高时，会对黄瓜种子的萌发产生负面作用，在田间实际使用时需要谨慎控制添加量；在黄瓜种子的发芽期，建议DCD 的施用量控制在1～5 μmol·mL-1，DMPP 施用量控制在0.1～0.5 μmol·mL-1，较为安全。同时，再配施一定量的氮肥可以有效提高黄瓜种子的发芽与幼苗生长效率。

淀粉酶主要作用于淀粉分子的α-1,4 糖苷键，种子发芽时期，需要水解大量的淀粉，为后续幼苗发育提供坚实的物质基础和大量的能量[16]。淀粉酶活性降低时，会导致能量供应不足，影响植物生长。植物种子发芽时，代谢旺盛，会生成很多的中间代谢产物，如大量的活性氧[17]，细胞内的抗氧化防御系统可以抵御上述活跃化合物的攻击，CAT 可以分解H2O2，从而阻止了H2O2与其他物质的结合形成对细胞的有害产物[17-19]，当CAT 活性降低时，H2O2分解速率将降低，其在体内积累，对植物体产生一些毒害作用。因此，CAT 活性的高低可间接反映出种子活力的高低，它们之间呈正相关的关系。POD 也能够将H2O2还原成H2O，从而保护细胞，然而在逆境下，POD 会参与活性氧的生成，对细胞膜有破坏作用，因此可作为评价组织衰老程度的一种生理指标[18]。SOD 能够催化超氧阴离子自由基形成毒性较小的过氧化氢，进而被CAT分解，是保护细胞膜系统最重要的一种酶[20]。MDA 是膜脂过氧化后的产物，它可与蛋白质等活性物质结合，形成褐色沉积物，从而干扰细胞正常的生命活动[21]，其含量高低可间接反映种子受到伤害的程度。

在明确了黄瓜种子对DCD、DMPP 的施用敏感浓度范围基础上，本试验进一步探究两种硝化抑制剂施用条件下，黄瓜幼芽中淀粉酶、抗氧化酶活性等相关生理指标的变化，这些变化是黄瓜种子受到胁迫时做出的生理反应。从试验结果来看，1μmol·mL-1的DCD溶液便会触发种子细胞的保护机制，细胞可能动用各类途径，提高了相关酶的活性，使自身活性氧维持正常水平，随着浓度升高（5 μmol·mL-1），淀粉酶、SOD 等活性下降，这可能是受到了DCD 的胁迫，但通过MDA 含量与发芽率表现看，种子未表现出受到损伤，这可能是因为淀粉酶活性的下降，导致细胞代谢速率降低，细胞内产生活性氧的水平不高，仍能被清除，当DCD 浓度达到10 μmol·mL-1时，淀粉酶与三种保护性酶活性降至最低，MDA 含量上升，显示细胞可能受到了一定程度的损害。而低浓度的DMPP（0.1 μmol·mL-1）对黄瓜种子各生理指标无明显作用，随着DMPP浓度的增加（0.5 μmol·mL-1），毒害作用可能加强，组织内的活性氧含量迅速上升，激活了应激反应，刺激了SOD 活性增强，CAT、POD 活性虽有降低，但仍可使细胞内活性氧水平维持稳定，发芽率、淀粉酶活和MDA 含量也辅证了这一点。当DMPP 浓度达到最高时（1.0 μmol·mL-1），细胞内的抗氧化酶活性大幅下降，活性氧积累增加，MDA 含量升高，种子发芽率下降，细胞受到损伤。

有学者研究发现，对花生苗期施用硫脲，随着浓度升高，幼苗的生长与相关生理指标表现出低促高抑的现象，即低浓度硫脲对苗期花生生长有益，高浓度会抑制其生长[8]；也有报道显示，在大豆苗期中使用硫脲，低浓度的情况下就对其生长与相关酶活产生了抑制，高浓度情况下，抑制效果更为明显[10]。对小麦的研究结果显示，硫脲对小麦种子和幼苗的毒性相对较大，而DCD 的毒性相对较小[9]。本试验结果：高浓度的DCD、DMPP 均会对黄瓜种子的相关生理指标产生一定的负面影响，降低种子的发芽率，也证明过量使用硝化抑制剂，会对作物产生损害。

相对于环境稳定的试验室环境，田间具有更多的不确定因素，此外，不同的黄瓜品种及遗传背景对硝化抑制剂耐受性的表现可能也会有所不同，因此，DCD、DMPP 的安全用量与最佳施用浓度尚有待开展田间试验进一步完善。目前，国内学者对硝化抑制剂的研究大部分集中在对环境与经济效益方面，关于硝化抑制剂的毒理研究较少，并且DCD、DMPP 影响黄瓜种子相关生理指标变化的具体机制也有待进一步研究。