小鼠气道Club细胞发育特征分析

简鼎，王艺颖，朱琳，李媛媛,，张光莉，陈诗懿，罗征秀*

1重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地/儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014；2重庆医科大学附属儿童医院呼吸科，重庆 400014

气道上皮是呼吸系统抵御外界致病物质入侵的第一道屏障[1]。Club细胞是位于气道上皮黏膜处的细胞群，可特异性分泌Club细胞分泌蛋白(CC16)，并可充当干细胞/祖细胞参与气道上皮的损伤修复[2-4]。Club细胞及CC16在维持气道上皮的完整性中起关键作用[5-6]。研究证实，气道上皮损伤修复异常是哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等疾病的重要发病机制[7-8]，儿童早期CC16低表达与成年人哮喘、COPD发病密切相关[9-10]，提示生命早期Club细胞结构或功能异常可能是哮喘、COPD发生的重要因素。小鼠是研究Club细胞结构和功能的常见动物模型。Karnati等[11]曾对小鼠Club细胞的生物学特征进行研究，但未对出生后不同时期的Club细胞在各级气道中的分布、表达、增殖能力和分泌功能变化进行阐述。研究出生后不同时期Club细胞的发育特征对深入阐述气道上皮的损伤修复机制具有重要意义。本研究分析了BALB/c小鼠模型不同发育时期气道Club细胞的分布、表达、增殖和分泌等功能变化，以期为研究发育期Club细胞结构和(或)功能异常相关疾病提供更多的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器 清洁级BALB/c孕鼠12只(购自重庆医科大学实验动物中心)，单独饲养于独立通气的消毒饲养盒内，并提供恒定25 ℃室温、50%～65%湿度、12 h/d光照的环境条件。多聚甲醛购自北京索莱宝科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、胶原蛋白酶Ⅰ购自美国Sigma公司；抗CC16小鼠来源的单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；抗小鼠荧光二抗AF488、CD31-Biotin、CD34-Biotin、CD45-Biotin、Scal-1-APC、CD24-PE、streptavidin-APC-Cy7、Ki-67-PE-Cy7抗体和细胞固定剂、细胞通透液购自美国eBioscience公司；EpCAM-FITC抗体购自美国Biolegend公司；DAPI购自上海碧云天生物技术有限公司；红细胞裂解液购自北京天根生化科技有限公司；胎牛血清、Hank's平衡盐溶液购自美国Gibco公司；小鼠CC16 ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；Nikon C2 Plus激光共聚焦显微镜购自日本Nikon公司；流式细胞仪(FACSClibur)购自美国BD公司。

1.2 标本采集 孕鼠共生产54只新生小鼠，将小鼠分为出生后1周龄(新生期)、3周龄(幼年期)、6周龄(成年期)[12]，每个时期各18只。所有实验操作均在超净工作台内进行，实验过程符合国家及单位有关实验动物管理和使用的规定。将各组小鼠麻醉后心脏采血，用10 ml无菌PBS液进行心脏灌注至双肺发白。将右肺取出，每100 mg肺组织加入1 ml无菌PBS液，使用电动匀浆器匀浆。根据ELISA试剂盒要求，将外周血于4 ℃下1000×g离心20 min，肺匀浆于4 ℃下5000×g离心10 min后，均收集上清储存于–80 ℃。将左肺完整取出，用4%多聚甲醛溶液浸透固定，用于肺组织荧光染色。

1.3 免疫荧光检测各级气道Club细胞分布形态及表达丰度 气道Club细胞免疫荧光标记方法参考本课题组前期的研究基础[13]。将各组小鼠左肺于4%多聚甲醛中固定48 h，梯度乙醇脱水后石蜡包埋，连续切片(厚4 μm)，每组随机选取12只小鼠，每个肺组织选取3张连续切片。5%BSA封闭60 min，分别用抗CC16小鼠来源的单克隆抗体(1:100) 4 ℃孵育12 h，抗小鼠荧光二抗AF488(1:500)室温避光孵育50 min，DAPI室温避光孵育10 min，封片后在Nikon C2 Plus激光共聚焦显微镜下拍摄图像。选取气管分出的一级支气管为主支气管，并在相同位置采集图像；细支气管图像选取标准参考Watson等[14]对细支气管测量的研究数据。分别于200倍镜下采集5个主支气管横切面图像，400倍镜下采集6个细支气管横切面图像，600倍镜下采集主支气管及细支气管纵切面图像。使用NIS Element Viewer 5.20软件计算CC16相对于DAPI的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)作为反映气道Club细胞表达丰度的指标并进行组间比较[13]。

1.4 流式细胞术检测气道上皮中Club细胞百分比及增殖能力 参照本课题组前期的研究方法[15]，麻醉处死小鼠后取出肺组织，剪碎后于37 ℃条件下以0.1%胶原蛋白酶Ⅰ孵育15 min，然后置于不锈钢筛网(300目)上剪碎，将培养皿中获取的肺组织单细胞悬液于4 ℃下700×g离心5 min，去上清，加入1 ml红细胞裂解液重悬并静置2 min，PBS洗2次，4 ℃下700×g离心5 min，去上清，使用含2%胎牛血清的Hank's平衡盐溶液制成单细胞悬液。细胞表面染色：参照Li等[16]的方法，加入一抗CD31-Biotin(1:40)，CD34-Biotin(1:20)，CD45-Biotin(1:67)，EpCAM-FITC(1:100)，Scal-1-APC(1:100)和CD24-PE(1:25)于冰上孵育40 min；Hank's平衡盐溶液终止反应，加入二抗streptavidin-APC-Cy7(1:100)冰上孵育40 min。胞内染色：将细胞用固定剂固定30 min，4 ℃下700×g离心5 min，去上清，加入通透液常温通透5 min，4 ℃下700×g离心5 min，去上清后加入抗体Ki-67-PECy7(1:200)冰上孵育30 min。Hank's平衡盐溶液终止反应，流式细胞仪上机检测。CD31–CD34–CD45–EpCAM+Scal-1+CD24low鉴定为Club细胞[16]；Ki-67是一种与细胞增殖相关的核抗原[17]，可将Ki-67+Club细胞/Club细胞的比值作为指标比较各组Club细胞增殖能力的差异。

1.5 ELISA法检测小鼠CC16表达水平 取储存于–80 ℃的各组小鼠肺匀浆上清、血清，采用ELISA法检测小鼠CC16的表达水平，实验步骤按试剂盒说明书进行。

1.6 统计学处理 采用GraphPad Prim 8.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Games-Howell检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同时期BALB/c小鼠各级气道Club细胞分布及表达丰度比较 免疫荧光染色结果显示，新生期、幼年期和成年期小鼠主支气管Club细胞在气道上皮的表达位置参差不齐(图1A)，而细支气管Club细胞在气道上皮的分布形态平坦且均匀(图1B)。进一步分析发现，随鼠龄增长，新生期、幼年期和成年期主支气管Club细胞表达丰度逐渐下降，MFI分别为0.73±0.12、0.43±0.05、0.26±0.08，差异有统计学意义(P<0.05)(图2A)；此外，随鼠龄增长，新生期、幼年期和成年期细支气管Club细胞表达丰度逐渐增加，MFI分别为0.49±0.07、0.73±0.08、1.02±0.19，差异有统计学意义(P<0.05)(图2B)。

图1 不同鼠龄BALB/c小鼠主支气管(A)、细支气管(B)Club细胞的分布(免疫荧光染色)Fig.1 Comparison of Club cells distribution in main bronchus (A), bronchioles (B) in different ages of BALB/c mice model(Immunofluorescence staining)

图2 不同鼠龄BALB/c小鼠主支气管(A，n=5)、细支气管(B，n=6)Club细胞的表达丰度比较(免疫荧光染色)Fig.2 Expression abundance of Club cells in main bronchus (A, n=5), bronchioles (B, n=6) in different ages of BALB/c mice model (Immunofluorescence staining)

2.2 不同时期BALB/c小鼠气道上皮中Club细胞百分比及增殖能力比较 流式细胞术检测结果显示，新生期、幼年期和成年期Club细胞占气道上皮细胞的百分比分别为(9.49%±2.38%)、(15.45%±3.86%)、(17.23%±4.82%)，与新生期比较，幼年期和成年期气道上皮Club细胞百分比明显增加(P=0.028，P=0.022)，而幼年期与成年期比较差异无统计学意义(P=0.765)(图3A)；新生期、幼年期和成年期增殖性Club细胞的占比分别为(6.12%±1.89%)、(2.36%±0.98%)、(1.94%±0.75%)，幼年期和成年期Club细胞的增殖能力明显低于新生期(P=0.007，P=0.005)，而幼年期与成年期比较差异无统计学意义(P=0.690)(图3B)。

图3 流式细胞仪检测不同时期BALB/c小鼠气道上皮中Club细胞的占比(A)和增殖能力(B)(n=6)Fig.3 Proportion (A) and proliferation (B) of Club cells in airway epithelium in different ages of BALB/c mice model (Flow cytometry, n=6)

2.3 不同时期BALB/c小鼠肺组织匀浆、血清CC16表达水平比较 ELISA检测结果显示，随鼠龄增长，新生期、幼年期和成年期肺组织匀浆上清CC16表达水平分别为(64.02±12.70) ng/ml、(89.31±5.41) ng/ml、(95.74±3.31) ng/ml，与新生期比较，幼年期和成年期肺匀浆上清CC16表达水平明显升高(P=0.008，P=0.003)，而幼年期与成年期比较差异无统计学意义(P=0.085)(图4A)；此外，随鼠龄增长，新生期、幼年期和成年期血清CC16表达水平分别为(13.91±3.36) ng/ml、(25.77±4.68) ng/ml、(28.02±3.99) ng/ml，与新生期比较，幼年期和成年期血清CC16表达水平明显升高(P=0.002，P<0.001)，而幼年期与成年期比较差异无统计学意义(P=0.657)(图4B)。

图4 不同时期BALB/c小鼠肺组织匀浆(A)和血清(B)CC16表达水平比较(ELISA)(n=6)Fig.4 Expressive levels of CC16 in lung homogenates (A) and serum (B) in different ages of BALB/c mice model (ELISA) (n=6)

3 讨 论

气道上皮损伤是多种肺部疾病发病的重要机制[18-20]。Club细胞是一种异质性、多功能的气道上皮细胞，可作为干细胞/祖细胞及时有效地参与气道上皮的损伤修复[6]。有研究发现，早期CC16低表达与后期肺功能下降明显相关[10]，提示生命早期Club细胞的正常表达对维持后期气道功能稳定具有重要作用。目前对出生后不同时期Club细胞的生物学特征变化知之甚少，因此，本研究对生后不同鼠龄段的小鼠气道Club细胞进行分析，结果发现出生后Club细胞表达丰度不断增加的主要部位是小气道，而新生期则是气道Club细胞增殖及CC16表达增加的关键时期。

然而，本研究发现，大气道Club细胞的发育特征与小气道截然不同。Hogan等[21]发现，小鼠大气道为假复层纤毛柱状上皮，而小气道上皮由简单细胞排列构成，提示大、小气道Club细胞分布形态不同与相应气道细胞组成的差异有关。主支气管是气管分出的一级支气管，本研究发现主支气管Club细胞表达丰度随鼠龄增长逐渐下降，与Rawlins等[22]发现气管Club细胞在上皮细胞中的占比随鼠龄增长而下降一致，提示Club细胞占比或表达丰度随鼠龄增长而下降可能是大气道的共同特点。本研究还发现，随鼠龄增长，细支气管Club细胞表达丰度增加，与Karnati等[11]报道小气道Club细胞表达丰度的发育变化结果一致。此外，本研究发现，新生期Club细胞增殖能力最强，Club细胞在气道上皮中的占比从新生期至幼年期明显升高。Karnati等[11]发现，小鼠Club细胞平均体积在生后保持不变，但Club细胞总体积和总数量在出生后早期明显增加，提示Club细胞在新生期处于快速发育阶段。CC16作为气道含量最丰富的分泌蛋白，主要由Club细胞分泌产生，对维持气道上皮完整性具有重要作用[5]。本研究发现，小鼠肺部、血清CC16水平在生后早期明显升高，可能与小鼠Club细胞的胞内分泌颗粒数量及体积仅在新生期明显增多有关[11]，提示新生期是CC16水平增长的关键时期。

人类肺的发育过程与小鼠相似，均需经历气道的分支和延伸生长[23]，其中包括各类气道上皮细胞的发育与成熟。小气道Club细胞结构或功能损伤与哮喘、COPD等多种肺部疾病的发生密切相关[19,24-25]。了解小鼠大、小气道Club细胞的不同发育特征，不仅可为人体Club细胞的气道分布规律提供解释，也可为Club细胞功能失调相关疾病的机制研究提供实验平台。有研究发现，儿童早期呼吸道感染或环境暴露可能导致成年后的慢性肺部疾病[26]。流行病学及动物实验研究发现，新生期感染肺炎链球菌、呼吸道合胞病毒或过敏原暴露可促进后期气道高反应性和(或)哮喘的发生[27-28]，其机制与气道上皮损伤密不可分[29-30]，但这些不利因素是否导致Club细胞结构或功能损伤，从而参与疾病的发生发展尚需进一步研究明确。

综上所述，本研究对不同鼠龄段小鼠气道Club细胞的表达、增殖及分泌功能进行分析，补充了肺发育过程中Club细胞的生物学特征变化。但本研究仍存在一些局限性：仅分析了小鼠主、细支气管两个典型支气管解剖部位的Club细胞，未分析支气管树其他部位的Club细胞分布及表达特征，也未研究Club细胞的其他生物学特性如干细胞/祖细胞功能等。因此，后续应进一步加深对气道Club细胞多种生物学特征的研究，有望为发育期Club细胞结构和(或)功能异常相关疾病提供新的病因机制和治疗方向。