丹酚酸B对人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制

王慧莲，展俊平，苗喜云，孟庆良，马俊福

河南省中医院风湿病科，郑州 450000

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以炎性细胞浸润为特征的，滑膜、关节软骨和骨发生退变的系统性自身免疫性疾病[1]，其中滑膜炎症是最主要的病理表现[2]。滑膜成纤维细胞是滑膜的主要组成细胞，在RA发生发展过程中异常增生，并通过分泌炎性介质进一步导致滑膜炎症和软骨损伤，是RA治疗的重要靶细胞之一[3-4]。目前临床上多采用非甾体抗炎药、糖皮质激素、青霉胺等药物治疗RA，但易引发恶心、呕吐、中枢神经系统紊乱等不良反应，严重危害患者的健康[5]。近年来，中药因来源广、毒性小和药效高等特点，成为RA治疗的研究热点[6-7]。中药丹参常用于心血管疾病、糖尿病、皮肤病和关节炎等的治疗中[8]，其主要活性成分丹酚酸B(salvianolic acid B)具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗炎等功效[9]。但目前丹酚酸B对RA的治疗作用及其机制尚未明确。本研究探讨了丹酚酸B对人RA滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其机制，以期为丹酚酸B在RA中的应用和研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 丹酚酸B(纯度98%)购自上海源叶生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、Trizol试剂盒、反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司；MTT试剂盒购自美国Abcam公司；caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和β-actin蛋白一抗及二抗购自美国Santa Cruz公司；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)购自美国Sigma公司。流式细胞仪购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 细胞培养 人R A 滑膜成纤维细胞M H 7 A(JNO171-925)购自广州吉妮欧生物有限公司，培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和链霉素的DMEM培养基中。丹酚酸B用DMEM培养基配制为100 μmol/L的母液。取对数生长期MH7A细胞，接种于96孔板(2×103个/孔)进行药物处理和分组培养。

1.2.1 MTT法检测细胞增殖情况 MH7A细胞分别加入含终浓度为0、1、10、20、30、40和50 μmol/L丹酚酸B的培养基中培养48 h，随后加入终浓度为5 mg/ml的MTT，37 ℃孵育4 h；弃上清，加入150 μl DMSO，采用酶标仪检测490 nm波长处的吸光度(OD)值，并计算细胞增殖率。细胞增殖率(%)=(OD实验组－OD空白组)/OD空白组×100%。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 MH7A细胞分别加入含终浓度为0、30、40和50 μmol/L丹酚酸B的培养基中培养48 h，随后加入0.5%胰蛋白酶进行消化；离心重悬后，加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3 细胞分组及处理 取对数生长期MH7A细胞，接种于96孔板(2×103个/孔)中，设置对照组、丹酚酸B组与丹酚酸B+3-MA组。对照组正常培养，丹酚酸B组加入终浓度为50 μmol/L的丹酚酸B培养，丹酚酸B+3-MA组加入50 μmol/L丹酚酸B和5 mmol/L自噬抑制剂3-MA共同培养。培养48 h后，检测各组细胞增殖和凋亡情况，caspase-3mRNA和蛋白的表达情况，以及自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62的表达情况。

1.3.1 各组细胞增殖和凋亡情况检测 按照1.2.1和1.2.2方法检测各组细胞增殖和凋亡情况。

1.3.2 qRT-PCR检测capase-3mRNA相对表达水平

按Trizol试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA并测定其浓度。反转录获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。反应条件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，45个循环；72 ℃ 10 min。引物由上海生工生物工程有限公司合成。Caspase-3：正义链5'-GAATCCACGAGCAGAGTCAA-3'，反义链5'-TAGCCTTCAACAAGCCAACC-3'；β-actin：正义链5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反义链5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。以β-actin为内参，采用2–ΔΔCt法计算caspase-3mRNA的相对表达水平。

1.3.3 Western blotting检测caspase-3及自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62的相对表达水平

加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，行SDS-PAGE电泳，转模1 h，加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和β-actin蛋白一抗(1∶1000)4 ℃孵育过夜；漂洗后加入二抗(1∶10 000)室温孵育1 h。采用X线胶片曝光，用Image-Pro Plus 7.0软件分析，以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。实验数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，进一步两两比较采用Bonferroni法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 丹酚酸B 对M H 7 A 细胞增殖和凋亡的影响 M T T 法 检 测 结 果 显 示，与0 μ m o l/L 组 比较，1、10和20 μmol/L丹酚酸B处理对MH7A细胞增殖没有明显影响(P>0.05)，而30、40、50 μmol/L丹酚酸B组MH7A细胞增殖率明显降低(75.71%±5.36%、67.33%±6.32%、53.34%±2.73%vs.89.24%±3.10%)，且呈浓度依赖性(P<0.05，图1A)。流式细胞仪检测结果显示，与0 μmol/L组比较，30、40和50 μmol/L丹酚酸B组细胞凋亡率明显升高(15.7%±0.5%、22.5%±1.7%、30.1%±1.5%vs.11.2%±1.3%，P<0.05，图1B)。据此选择50 μmol/L丹酚酸B进行后续实验。

图1 丹酚酸B对MH7A细胞增殖和凋亡的影响Fig.1 Effect of salvianolic acid B on the proliferation and apoptosis of MH7A cells

2.2 丹酚酸B调节自噬对MH7A细胞增殖和凋亡的影响 与对照组比较，丹酚酸B组细胞增殖率明显降低，细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与丹酚酸B组比较，加入自噬抑制剂3-MA处理的MH7A细胞增殖率明显升高(63.47%±1.94%vs. 51.33%±4.67%)，细胞凋亡率明显降低(21.4%±1.8%vs. 30.4%±0.6%)，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2 丹酚酸B调节自噬对MH7A细胞增殖和凋亡的影响Fig.2 Effect of salvianolic acid B on the proliferation and apoptosis of MH7A cells by regulating autophagy

2.3 丹酚酸B调节自噬对MH7A细胞中caspase-3mR NA和蛋白以及自噬相关蛋白表达的影响Western blotting和qRT-PCR检测结果显示，与对照组比较，丹酚酸B组MH7A细胞中caspase-3mRNA(1.27±0.15vs. 0.61±0.03)和蛋白(1.10±0.09vs.0.42±0.07)相对表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与丹酚酸B组比较，丹酚酸B+3-MA组MH7A细胞中caspase-3mRNA(0.83±0.06)和蛋白(0.64±0.05)相对表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，图3A、B)。

Western blotting检测结果显示，与对照组比较，丹酚酸B组MH7A细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(1.23±0.21vs. 0.23±0.03)、Beclin-1(1.05±0.08vs.0.22±0.04)蛋白相对表达水平升高，p62(0.20±0.02vs.1.38±0.08)蛋白相对表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与丹酚酸B组比较，丹酚酸B+3-MA组MH7A细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(0.29±0.07)、Beclin-1(0.36±0.05)蛋白相对表达水平降低，p62(0.97±0.06)蛋白相对表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05，图3C)。

图3 丹酚酸B调节自噬对MH7A细胞中caspase-3及自噬相关蛋白表达的影响Fig.3 Effect of salvianolic acid B on the expressions of caspase-3 and autophagy related protein in MH7A cells by regulating autophagy

3 讨 论

RA是一种慢性自身免疫性疾病，临床上该病患者的关节结构发生破坏和畸变，关节功能受到影响，严重影响患者的生活质量[10]。RA滑膜成纤维细胞的增殖与凋亡失衡是引起滑膜增生和关节炎症的主要原因[11]。一方面，滑膜成纤维细胞增生对软骨和骨关节等组织进行直接的浸润和破坏；另一方面，滑膜成纤维细胞可通过募集免疫细胞并与其相互作用促进机体炎症反应，间接破坏骨关节[12]。因此，调控滑膜成纤维细胞是药物治疗RA的重要机制之一。

丹酚酸B是丹参的主要活性成分[13]。近年来研究发现，丹酚酸B具有抑制细胞异常增殖、诱导细胞凋亡的作用[14]。但目前关于丹酚酸B对RA滑膜成纤维细胞作用的研究较少。本研究采用不同浓度的丹酚酸B作用于MH7A细胞，结果显示，低浓度(1、10、20 μmol/L)的丹酚酸B对MH7A细胞增殖没有明显影响，而30～50 μmol/L的丹酚酸B可呈浓度依赖性的抑制MH7A细胞的增殖。进一步检测有效浓度的丹酚酸B对MH7A细胞凋亡的影响，结果显示，丹酚酸B可明显促进MH7A细胞凋亡。由此可见，丹酚酸B能够有效抑制RA滑膜成纤维细胞的增殖并促进其凋亡，提示丹酚酸B可能对RA有治疗作用。

目前RA的病因和发病机制尚未完全明确。有研究发现，细胞自噬是RA进展的重要调节机制之一[15]。自噬又称为Ⅱ型程序性死亡，是可溶性大分子或细胞器等被运送到溶酶体进行降解的过程，在维持细胞稳态和生存方面发挥着重要作用[16]。Beclin-1(又称Atg6)是自噬调节的关键因子之一，可与其他Atg蛋白协同调节自噬体的形成，进而调控细胞自噬过程[17]。LC3是检测自噬活性的标志蛋白[18]。在自噬过程中，胞质内的Ⅰ型LC3蛋白经过泛素样加工修饰后，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺结合形成Ⅱ型LC3蛋白。LC3-Ⅱ蛋白特异性地结合至自噬泡膜表面，并在自噬体形成过程中发挥重要作用，因此常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值评估自噬水平[19]。衔接蛋白p62可与LC3相互结合，是自噬受体和自噬的选择性底物[20]。有研究发现，丹酚酸B可通过促进细胞自噬减缓肾炎、肾纤维化、帕金森病、结直肠癌等疾病的发展[21-24]。本研究结果显示，与对照组比较，丹酚酸B组MH7A细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达上调，p62表达下调，表明丹酚酸B可促进RA滑膜成纤维细胞的自噬过程。

自噬广泛参与心血管疾病、肿瘤、神经退行性疾病和自身免疫性疾病的发生和发展[25]。许珂等[26]发现，甲氨蝶呤可通过诱导细胞自噬而促进RA滑膜成纤维细胞的凋亡，提高RA的治疗效果。范紫微等[27]研究发现，五味子木脂素可通过促进自噬而抑制关节炎大鼠的炎症反应。本研究采用自噬抑制剂3-MA和丹酚酸B共处理MH7A细胞，结果显示，MH7A细胞增殖率明显升高，细胞凋亡率明显降低，表明丹酚酸B对RA滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的调控作用可能是通过促进自噬产生的。

综上所述，本研究结果显示，丹酚酸B可通过促进细胞自噬抑制RA滑膜成纤维细胞的增殖并促进其凋亡。但本研究未在RA动物模型中探索丹酚酸B的药物毒性和适用浓度，后续研究可在骨关节炎动物模型中验证丹酚酸B的作用，并探索其衍生物和适用剂型，为丹酚酸B在临床RA治疗中的应用提供理论依据。