免疫磁珠—环介导等温扩增快速检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的四环素耐药基因tetL

李雪利，汪思源，翟征远，林建涵，郝彦玲

（1.中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京100083；2.中国农业大学 信息与电气工程学院，北京100083）

0 引言

兽用抗生素在治疗动物疾病方面发挥重要作用，其中四环素类抗生素是治疗奶牛乳房炎常用抗生素[1]，而抗生素的残留会导致耐药微生物的出现。蜡样芽孢杆菌是一种广泛存在于土壤、污水和空气等环境中的革兰氏阳性菌[2]，在不利的生长条件下能产生抗逆性极强的芽孢，当环境适宜时，芽孢又可萌发成菌体细胞[3]，因此，蜡样芽孢杆菌的芽孢能够经受巴氏灭菌，被认为是巴氏杀菌乳中主要残留微生物[4]。Yusuf等[5]从乳制品中分离出19株耐四环素蜡样芽孢杆菌，Cui等[6]从生牛乳和奶牛场环境分离出16株耐四环素蜡样芽孢杆菌。由此可知，耐四环素蜡样芽孢杆菌在乳制品中广泛存在。Bernhard等[7]证实蜡样芽孢杆菌中四环素抗性质粒PBC16可转移到枯草芽孢杆菌，AgersO等[8]检测到蜡样芽孢杆菌中四环素耐药基因可转移至金黄色葡萄球菌和肠球菌。因此，蜡样芽孢菌中的四环素耐药基因的转移性会给人类健康带来严重的威胁。

基于培养方法的微生物耐药表型检测，因灵敏性差，耗时长，无法实现快速检测[9]。而分子生物学检测技术可实现快速准确的检测，其中环介导等温扩增（LAMP）是由Notomi等[10]建立的一种恒温核酸扩增技术，能够在恒温条件下实现目标基因的快速、特异性检测。免疫磁珠分离（IM S）是一种能将目标菌与干扰菌快速分离的方法[11]，现已在单增李斯特菌[12]、沙门氏菌[13]、大肠杆菌[14]、蜡样芽孢杆菌[15]的富集上广泛应用。将IMS与LAMP检测技术结合，已成为一种新型检测目标菌的方法。目前已有文献利用IMS-LAMP方法快速检测牛肉中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌[16]、海产品中的副溶血性弧菌[17]和霍乱弧菌[18]、牛奶中的大肠杆菌O157:H 7[19]和鸡肉中的沙门氏菌[20]，但在巴氏杀菌乳中利用IMS-LAMP方法快速检测耐四环素蜡样芽孢杆菌的研究尚未见报道。本研究将IMS技术与LAMP技术相结合实现巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

耐复方新诺明蜡样芽孢杆菌BA008、耐四环素蜡样芽孢杆菌BA117、耐克林霉素地衣芽孢杆菌BA130、耐克林霉素短小芽孢杆菌BA102、大肠杆菌ATCC 80739为实验室保存。

1.1.2 试剂

链霉亲和素纳米磁珠，Ocean Nanotech公司；生物素标记的芽孢杆菌抗体，EastCoast Bio公司；WarmStartRLAMP Kit(DNA&RNA)，New England BioLabs公司；牛血清蛋白（BSA），EM Science公司；氯化钠和胰蛋白胨，Oxoid公司；牛肉浸粉，北京奥博星生物公司；吐温-20，Amresco公司；1×PBS（磷酸盐缓冲液），Sigma Aldrich公司；1×PBST（PBS中加入0.05%Tween-20）；其它试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。巴氏杀菌乳，市售。

1.1.3 仪器设备

实时荧光定量PCR仪，BIO-RAD公司；场发射透射电镜，北京中科百测公司；恒温培养箱和磁力架，Thermo Fisher Scientific公司；超声仪，福建致微仪器公司；垂直混匀仪，上海强运公司；低速离心机，宁波拓普森仪器公司；Milli-Q超纯水仪，Millipore Advantage公司；电子天平，Mettler Toledo公司；恒温摇床，Benchmarker公司；小型涡旋振荡器，Scientific Industries公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫磁珠的制备

向20μL 150 nm磁珠溶液（1 mg/mL）加入500μL PBST（0.01 mol L-1，p H 7.4），清洗磁珠3次，在磁力架上回收磁珠3 min，沉淀用500μL PBS（0.01 mol L，p H 7.4）重悬，然后加入适量的2.5 mg/mL芽孢杆菌抗体，混匀后置于垂直混匀仪上室温反应；反应完的溶液在磁力架上静置3 min弃去上清，用500μL PBST（0.01 mol/L，p H 7.4）洗涤1次，弃上清，免疫磁珠用PBS（0.01 mol/L，p H 7.4）重悬至终浓度为1 mg/m L，并于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 免疫磁珠富集条件优化

1.2.2.1 抗体使用量的优化

向清洗后的20μL磁珠溶液中分别加入0、2.5、5、7.5、10μg芽孢杆菌抗体，按1.2.1制备免疫磁珠。取20μL免疫磁珠加入500μL含有103CFU/m L耐四环素蜡样芽孢杆菌的人工污染乳，于混匀仪上反应1 h，磁力架上静置3 min，沉淀用PBS重悬并涂于营养琼脂平板，30℃培养24 h后计数，并计算捕获效率。

捕获效率（%）=（免疫磁珠富集的菌落数/免疫磁珠富集前菌落数）×100%

1.2.2.2 免疫磁珠用量的优化

按1.2.1制备免疫磁珠，取免疫磁珠10、15、20、25、30μL，分别加入500μL含有103CFU/m L耐四环素蜡样芽孢杆菌的人工污染乳，在混匀仪上反应1 h后，磁力架上静置3 min，沉淀用PBS重悬并涂于营养琼脂平板，30℃培养24 h后计数，并计算捕获效率。

1.2.2.3 免疫磁珠捕获时间的优化

按1.2.1制备免疫磁珠，取最适添加量的免疫磁珠加到500μL含有103CFU/mL耐四环素蜡样芽孢杆菌的人工污染乳，分别在混匀仪上反应30、45、60、75、90 min，磁力架上静置3 min，沉淀用PBS重悬并涂于营养琼脂平板，30℃培养24 h后计数，并计算捕获效率。

1.2.2.4 透射电镜观察免疫磁珠—目标菌复合物

按1.2.1制备免疫磁珠，取最适添加量的免疫磁珠加到500μL含有107CFU/mL耐四环素蜡样芽孢杆菌的人工污染乳，在最佳免疫时间内于混匀仪上反应，磁力架上静置3 min，沉淀用dd H2O重悬，吸取10μL免疫磁珠—蜡样芽孢杆菌的混合悬液滴加于载样铜网上，室温静置干燥过夜，用于后续透射电镜观察。

1.2.3 LAMP检测方法的建立

1.2.3.1 DNA模板制备及引物的合成

利用优化后的条件富集巴氏杀菌乳中的耐四环素蜡样芽孢杆菌，将富集的目标菌置于金属浴100℃热裂解10 min，冰浴5 min，10 000 rpm离心1 min，取上清作模板，-20℃保存。

使用软件Primer Explorer V4设计蜡样芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 LAMP反应引物

LAMP反应体系为25μL，各成分为：外引物（F3和B3）各0.2μmol/L、内引物（FIP和BIP）各1.6μmol/L、环引物（Loop B）0.4μmol/L，DNA模板5μL，染料0.5μL，超纯水补充体积至25μL。LAMP反应在实时荧光定量PCR仪上进行，反应条件为：65℃、1 min，共44个循环，每个循环结束后收集荧光信号。

1.2.3.2 LAMP引物的特异性

按1.2.3.1方法检测浓度为103CFU/mL的大肠杆菌，根据扩增曲线判定该LAMP引物的特异性。

1.2.4 人工污染乳中蜡样芽孢杆菌耐四环素tetL基因的检测

取25 mL巴氏杀菌乳与225 mL PBS充分混匀，将耐四环素蜡样芽孢杆菌梯度稀释至2.4×103~2.4 CFU/mL，用建立的IMS-LAMP方法检测，确定该方法检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的检测限。

1.2.5 数据处理

所有实验均做3次生物学重复，根据3次实验结果计算平均值和标准偏差，采用Graphpad Prism 7.0软件中t检验比较两组间的均值，并将P≤0.05确定为统计学上的显著性阈值[17]。

2 结果

2.1 抗体用量优化

取不同体积的芽孢杆菌抗体和20μg磁珠偶联制备免疫磁珠，结果如图1所示，当抗体用量从2.5μg增加到7.5μg时，捕获效率从53.1%增加到66.0%，随着抗体用量增加，对蜡样芽孢杆菌BA117的捕获效率没有明显提高（P＞0.05）。因此，每微克磁珠偶联抗体的最佳用量为375 ng。

图1抗体用量优化

2.2 免疫磁珠用量优化

向反应体系添加不同量的免疫磁珠捕获蜡样芽孢杆菌BA117，根据捕获效率确定实验最佳的免疫磁珠用量。从图2可知，当免疫磁珠添加量为25μL时，捕获效率达68.0%。随着免疫磁珠用量增加，对蜡样芽孢杆菌BA117的捕获效率有所降低，但不显著（P＞0.05）。故选用25μL作为免疫磁珠最适添加量。

2.3 免疫时间优化

将25μL免疫磁珠和蜡样芽孢杆菌BA117菌液进行不同时间的孵育后，计算捕获效率。结果如图3所示，当免疫时间在30~60 min时，随着免疫时间的增加，捕获率由31.5%显著增加至68.1%（P＜0.05）；当免疫时间大于60 min，捕获效率随着免疫时间的增加而降低至55.7%（P＜0.05）。因此选择60 min作为最佳免疫时间。

图2免疫磁珠用量优化

图3免疫时间优化

2.4 免疫磁珠特异性实验

选取3株芽孢杆菌和1株大肠杆菌对免疫磁珠进行了特异性检测，从图4可以看出，免疫磁珠对3株芽孢杆菌的捕获效率分别是蜡样芽孢杆菌BA008为68.9%、地衣芽孢杆菌BA130为50.8%、短小芽孢杆菌BA102为45%，而免疫磁珠对大肠杆菌捕获率仅为1.1%，证明本实验所用免疫磁珠对蜡样芽孢杆菌具有很高的特异性。

图4免疫磁珠特异性检测

此外，为了进一步确认免疫磁珠和蜡样芽孢杆菌的免疫结合，利用透射电镜对免疫磁珠-蜡芽孢杆菌BA117复合物进行观察，证明免疫磁珠捕获到了目标菌。

图5免疫磁珠-蜡样芽孢杆菌复合物

2.5 LAMP引物特异性检测

选取大肠杆菌作为非目标菌检测LAMP引物特异性，结果如图6所示，只有携带四环素耐药基因tetL的蜡样芽孢杆菌BA117有扩增曲线，大肠杆菌呈阴性结果。证明所设计的LAMP引物具有良好的特异性，与非目标菌不存在交叉反应。

图6 LAMP引物特异性检验

2.6 IMS-LAMP检测技术的灵敏度

用建立的IMS-LAMP方法检测巴氏杀菌乳中2.4×103~2.4 CFU/mL的耐四环素蜡样芽孢杆菌BA117，结果如图7所示，该方法可检测到巴氏杀菌乳中24 CFU/mL的耐四环素蜡样芽孢杆菌BA117。

图7 IMS-LAMP技术的灵敏度

3 讨论

在实际检测巴氏杀菌乳中耐药蜡样芽孢杆菌时，由于基质复杂，同时可能存在其它菌的干扰，很难对目标菌进行高灵敏、高特异性的检测，因此在进行LAMP检测前需要对样品进行前处理。苑学霞等[21]为了提高LAMP检测牛奶中致病微生物的灵敏度，增加了18~24 h增菌处理，柏建山等[22]在建立LAMP检测乳粉中阪崎肠杆菌方法时，通过对样品进行18~22 h的增菌培养降低了检出限。虽然通过增菌处理降低了LAMP检测方法的检出限，但是延长了检测时间，无法实现快速检测。IMS是一种无需微生物增菌并能消除食品基质影响的前处理方法，可以对样品中的目标菌进行快速富集[16]，目前已有文献利用免疫磁珠富集牛奶、食品和蔬菜中的蜡样芽孢杆菌[23-24]。因此，我们建立了IMSLAMP方法快速检测巴氏杀菌乳中耐四环素蜡样芽孢杆菌，包括免疫磁珠富集样品中耐四环素蜡样芽孢杆菌（60 min），热裂解快速获取目标DNA（20 min），LAMP扩增tetL四环素耐药基因（50 min），该方法在2 h内对耐四环素蜡样芽孢杆菌的检出限可达2.4 CFU/mL。

本实验选用了链霉亲和素标记磁珠和生物素标记芽孢杆菌多抗制备免疫磁珠，对巴氏杀菌乳中耐四环素蜡样芽孢杆菌进行富集。当不添加抗体时，链霉亲和素磁珠对目标菌的捕获率约40%，推测可能是磁珠表面的链霉亲和素和蜡样芽孢杆菌表面蛋白非特异性吸附造成的。此外，在优化的最适条件下，免疫磁珠对巴氏杀菌乳中103CFU/m L耐四环素蜡样芽孢杆菌的捕获率为68.1%，当免疫时间延长，并没有提高捕获效率，可能是由于抗体和蜡样芽孢杆菌表面蛋白结合力不强，反应过程的轻摇振荡导致蜡样芽孢杆菌和免疫磁珠的分离。此外，本实验选用的LAMP试剂盒配有荧光染料，使LAMP反应可以在实时荧光定量PCR仪上进行实时检测，既避免了开盖造成气溶胶污染，也避免了肉眼观察造成误差，提高了检测灵敏度。值得注意的是，DNA的提取也是提高LAMP检出限的关键因素，本研究由热裂解5 min改为热裂解10 min，冰浴5 min，检出限提高了一个数量级。

在实际生产的巴氏杀菌乳中芽孢杆菌污染浓度低于103CFU/mL[25]，因此本实验选取含有103CFU/m L耐四环素蜡样芽孢杆菌的巴氏杀菌乳作为实验对象。此外，GB 19645—2010《食品安全国家标准 巴氏杀菌乳》中微生物限量规定金黄色葡萄球菌和沙门氏菌不得检出，大肠菌群最大限量为2 CFU/m L[26]，故将大肠杆菌作为检测过程中的干扰菌。本研究结果证实了IMS-LAMP方法检测蜡样芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的可行性，今后将进一步利用该方法检测蜡样芽孢杆菌中其它具有潜在转移的耐药基因，建立高通量耐药基因的检测方法，为乳制品中耐药芽孢杆菌的快速检测提供新的方法。